木荷生長與開花相關內參基因篩選方法、引物及應用與流程
2024-04-15 16:10:05
1.本發明屬於分子生物學技術領域，特別涉及木荷生長與開花相關內參基因篩選方法、引物及應用。
背景技術：
2.木荷是廣泛分布於我國南方地區重要的用材和森林防火樹種，同時也是重要的林木花卉觀賞樹種。目前，國內研究人員已利用常規手段對該樹種開展長時間的育種研究，選育了一系列林木良種。然而，隨著分子生物技術在林木育種的普及，該樹種已初步進入分子育種行列。通過修飾特定基因的表達以獲得人們所需林木重要性狀是目前生物領域最有效的遺傳改良手段，獲得具有調控目標性狀的功能基因是實現該技術的前提。
3.利用螢光定量pcr(qrt-pcr)方法進行候選基因的表達驗證是常用的手段，該方法需要在不同材料表達穩定的內參基因進行目的基因的歸一化分析。因此，針對不同材料篩選適宜的內參基因是開展候選基因表達研究的基礎。
4.現有研究報導(zhongyi yang,rui zhang,zhichun zhou.identification and validation of reference genes for gene expression analysis in schima superba.2021,12,732.doi:org/10.3390/genes12050732)了木荷次生木質部、次生韌皮部、成熟葉、芽、一年生果實和組培苗繼代培養的根等不同組織的內參基因篩選，最後篩選出ssuact、ssurib作為適宜的內參基因組合。但這些內參基因使用範圍有限，既不適用於材積性狀存在顯著差異的個體，也不適用於以花器官為主要材料的木荷不同組織。
技術實現要素：
5.本發明的首要目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供一種木荷生長與開花相關內參基因的篩選方法。
6.本發明的另一目的在於提供一種木荷生長與開花相關的內參基因，適用於木荷生長發育以及開花研究。
7.本發明的再一目的在於提供所述木荷生長與開花相關內參基因的應用。
8.本發明的目的通過下述技術方案實現：
9.一種木荷生長與開花相關內參基因的篩選方法，包括如下步驟：
10.(1)材料選擇：
11.分別取m個材積差異顯著的木荷單株的成熟葉片，獲得m個不同材積來源的實驗材料；分別取其他任意1個木荷單株(除已經取的m個材積差異顯著的木荷單株外的其他任意單株)的n個不同組織，獲得n個不同組織來源的實驗材料；再將不同材積來源的實驗材料和不同組織來源的實驗材料共同組成全部樣本材料，即共獲得(m+n)個樣本；最後分別對(m+n)個樣本提取總rna，並反轉錄cdna；其中，m≥10，n≥12；
12.(2)引物設計：
13.根據候選內參基因的核苷酸序列分別設計引物，得到特異性擴增候選內參基因的
pcr引物；其中，所述候選內參基因包括ef1-α1、ef1-α2、gapdh1、ef2、nadp-gpd、cys、ef-ts、ubiquitin1、ubiquitin2、abc transporter1、abc transporter2、if2、nadh1、ef-1γ、eif2、if-iia、actin1和actin2基因；
14.(3)穩定性評價：
15.以cdna為模板，利用特異性擴增候選內參基因的pcr引物分別進行qrt-pcr擴增，獲得ct值，並進一步計算得到平均標準差(msd)；然後分別針對不同材積來源的實驗材料、不同組織來源的實驗材料以及全部樣本材料，利用δct、genorm、normfinder、bestkeeper和reffinder方法中的至少三種對候選內參基因的穩定性進行評價；再根據穩定性評價結果，將所述候選內參基因按照穩定性由強到弱進行排序，篩選得到木荷的內參基因或內參基因組合。
16.步驟(1)中所述的顯著差異是通過計算方差分析(anova)計算得到材積差異顯著的家系子代，其中材積有固定計算公式為：ht
1.01545
×
dbh
1.81296
×
6.29692
×
10-5
，式中ht是樹高，dbh是胸徑。
17.步驟(1)中所述的不同組織包括成熟葉片、葉柄、芽、花瓣、雄蕊、雌蕊、未成熟果實、成熟果實、新生花器官以及不同發育階段的枝條。
18.所述的新生花器官為剛形成但尚未展開的整個花器官。
19.所述的不同發育階段的枝條為從枝條的末端開始，從嫩枝到老枝，連續取3個以上不同發育階段的枝條。
20.步驟(1)中所述的m和n的取值範圍可以根據實際需要進行，總樣本量(m+n)≥22。
21.步驟(2)中所述的特異性擴增候選內參基因的pcr引物根據內參基因的核苷酸序列進行設計，使得pcr產物片段大小在80～300bp(優選101～250bp)之間，然後根據凝膠電泳條帶和qrt-pcr溶解曲線進行篩選，選擇電泳條帶單一且溶解曲線為單一峰所對應的引物作為特異性擴增候選內參基因的pcr引物；優選為分別如seq id no.1～36所示；進一步優選為如seq id no.1～4、seq id no.25～26以及seq id no.29～30所示。
22.步驟(2)中所述的ef1-α1、ef1-α2、gapdh1、ef2、nadp-gpd、cys、ef-ts、ubiquitin1、ubiquitin2、abc transporter1、abc transporter2、if2、nadh1、ef-1γ、eif2、if-iia、actin1和actin2基因的核苷酸序列分別如seq id no.37～54所示。
23.步驟(2)中所述的內參基因優選為ef1-α1、ef1-α2、nadh1和eif2，其基因序列分別如seq id no.37、seq id no.38、seq id no.49和seq id no.51所示。
24.步驟(3)中所述的篩選可以選擇綜合排序第一和/或第二的候選基因作為木荷的內參基因或內參基因組合。
25.步驟(3)中，對於不同材積來源的實驗材料，其內參基因優選為nadh1和eif2基因中的至少一種。
26.步驟(3)中，對於不同組織來源的實驗材料，其內參基因優選為ef1-α1和ef1-α2基因中的至少一種。
27.步驟(3)中，對於全部樣本材料，其內參基因優選為ef1-α1和eif2基因中的至少一種。
28.一種木荷生長與開花相關的內參基因，其內參基因具體如下：
29.(i)對於來自不同材積的木荷單株的實驗材料，其內參基因為nadh1和eif2基因中
的至少一種；
30.(ii)對於來自同一木荷單株的不同組織的實驗材料，其內參基因為ef1-α1和ef1-α2基因中的至少一種；
31.(iii)對於來自不同材積的木荷以及來自木荷的不同組織的實驗材料(即對於所有樣本材料)，其內參基因為ef1-α1和eif2基因中的至少一種。
32.步驟(i)中所述的實驗材料優選為材積差異顯著的木荷單株；更優選為材積差異顯著的木荷單株的成熟葉片。
33.步驟(i)中，用於擴增nadh1基因的引物序列如seq id no.25～26所示，用於擴增eif2基因的引物序列如seq id no.29～30所示。
34.步驟(ii)中所述的不同組織包括成熟葉片、葉柄、芽、花瓣、雄蕊、雌蕊、未成熟果實、成熟果實、新生花器官以及不同發育階段的枝條。
35.所述的不同發育階段的枝條為從枝條的末端開始，從嫩枝到老枝，連續取3個以上不同發育階段枝條。
36.步驟(ii)中，用於擴增ef1-α1基因的引物序列如seq id no.1～2所示，用於擴增ef1-α2基因的引物序列如seq id no.3～4所示。
37.步驟(iii)中，用於擴增ef1-α1基因的引物序列如seq id no.1～2所示，用於擴增eif2基因的引物序列如seq id no.29～30所示。
38.所述的木荷生長與開花相關內參基因在實時螢光定量pcr(qrt-pcr)中的應用。
39.所述的木荷生長與開花相關內參基因在木荷生長、開花和/或種子(種實形成)相關基因的表達分析中的應用。
40.所述的木荷生長與開花相關內參基因在篩選與木荷生長、開花和/或種子形成相關的基因中的應用。
41.所述的木荷生長與開花相關內參基因在木荷育種方面的應用。
42.本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果：
43.(1)本發明針對材用、觀賞花卉、種子形成等經濟性狀基因功能研究需求篩選表達穩定的內參基因，採用轉錄組初選、qrt-pcr驗證、多種方法比較分析對候選內參基因進行篩選，該技術流程簡潔、高效，適於多數林木相關性狀內參基因篩選需求，採用多種方法評選出的內參基因具有較高的穩定性且兼具針對性和廣泛適用性，為木荷相關生理過程基因功能研究提供了重要參考。
44.(2)本發明解決了木荷樹種利用qrt-pcr方法進行目標基因表達量定量研究過程中內參基因缺乏的問題，主要涉及材積性狀顯著差異的個體及以花器官為主的不同組織，利用δct、genorm、normfinder、bestkeeper、reffinder等不同算法對18個候選內參基因的穩定性進行了評價，綜合分析表明，nadh1和eif2適用於不同材積木荷單株，ef1-α1和ef1-α2適用於不同的組織(包含花器官等)，而ef1-α1和eif2是可適用於全部樣本。
45.(3)本發明方法所用材料來源廣：本技術針對木荷材用這一最重要的經濟性狀，選擇表型顯著差異的試驗材料，有助於高產木荷優良品系選育與基因功能研究；此外，花器官與種子形成密切相關，選擇相關的組織材料有助於研究木荷開花和種實形成相關生理過程基因功能研究。以上所述為木荷最關注的研究熱點，針對相關組織材料篩選內參基因有助於基因功能研究。
46.(4)本發明方法中的內參基因種類豐富：本技術所涉及候選內參基因與現有技術存在明顯差別，主要涉及ef1-α1、ef1-α2、gapdh1、ef2、nadp-gpd、cys、ef-ts、ubiquitin1、ubiquitin2、abc transporter1、abc transporter2、if2、nadh1、ef-1γ、eif2、if-iia、actin1、actin2等18個基因，與現有報導相比，ef1-α、ef2、nadp-gpd、cys、ef-ts、ubiquitin、abc transporter、if、nadh、ef-1γ、eif、if-iia為未曾報導的基因種類；其中，ef1-α1、ef1-α2、cys、nadh1、eif2為表達最穩定的候選內參基因，為未來的基因研究提供重要參考。
附圖說明
47.圖1是本發明技術流程圖。
48.圖2是18個候選內參基因擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖(dna marker：100～5000bp)。
49.圖3是18個候選內參基因的熔解曲線圖。
50.圖4是候選內參基因在全部樣本的ct值分布情況圖(箱型圖表示第25和75個百分位數；正方形代表中值；
×
代表最大值和最小值)。
51.圖5是基於genorm分析候選內參基因表達穩定性及最佳內參基因數量分析結果圖；其中，a和d為不同材積木荷的分析結果；b和e為不同組織的分析結果；c和f為全部樣本的分析結果。
52.圖6是基於reffinder分析候選內參基因的表達穩定性測試結果圖；其中，a為不同材積木荷的測試結果；b為不同組織的測試結果；c為全部樣本的測試結果。
53.圖7是利用6個內參基因對目的基因sscsl1與sscsl2表達量的對比分析結果圖；其中，a為目的基因sscsl1；b為目的基因sscsl2。
具體實施方式
54.下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。除非特別說明，本發明採用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。下列實施例中未註明具體實驗條件的試驗方法，通常按照常規實驗條件或按照製造廠所建議的實驗條件。除非特別說明，本發明所用試劑和原材料均可通過市售獲得。
55.實施例1
56.(1)植物材料選擇和轉錄組測序(技術流程圖如圖1所示)：
57.隨機選擇10個材積差異顯著的木荷單株(來自廣東省林業科學研究院)(顯著差異是通過計算方差分析(anova)計算得到10個材積差異顯著的家系子代。材積有固定計算公式為：ht
1.01545
×
dbh
1.81296
×
6.29692
×
10-5
，其中ht是樹高，dbh是胸徑。10個單株是每個家系選1個)，收集其成熟葉片；同時選擇其他任意一個木荷單株(並非來自上述10個木荷單株)，收集其成熟葉片、葉柄、芽、花瓣、雄蕊、雌蕊、未成熟果實、成熟果實、新生花器官(即剛形成但尚未展開的整個花器官)以及不同發育階段的枝條(從枝條的末端開始，從嫩枝到老枝，連續取3個不同發育階段的枝條)等12個組織為材料，分別提取總rna，反轉錄cdna，然後委託北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉錄組測序。
58.(2)候選內參基因篩選、引物設計與特徵分析
59.利用木荷轉錄組測序獲得的全部基因fpkm值，結合基因注釋功能，初步選擇表達最穩定的基因作為候選內參基因。具體利用fpkm計算各基因在22個樣品(22個樣本分別是上述10個木荷單株的成熟葉片樣本(分別命名為：ss1-l、ss2-l
……
ss10-l)和1個單株的12個組織(分別命名為：成熟葉片(l)、葉柄(pe)、芽(pi)、花瓣(yf)、雄蕊(s)、雌蕊(bu)、未成熟果實(f0)、成熟果實(fr)、新生花器官(p)以及不同發育階段的枝條(b1、b2、b3)，其中這個單株並非來自上述10個木荷單株，為其他任意的木荷單株，每個組織取18份以上樣本(平均分為3份，即3次重複))中的標準差和變異係數，結合文獻報導的常見內參基因類型，初步確定18個候選內參基因(表1)，包括ef1-α1、ef1-α2、gapdh1、ef2、nadp-gpd、cys、ef-ts、ubiquitin1、ubiquitin2、abc transporter1、abc transporter2、if2、nadh1、ef-1γ、eif2、if-iia、actin1和actin2基因，其基因序列如seq id no.37～54所示。
60.接著，利用primer 3設計合適的引物，pcr產物長度通常在80～300bp，本技術設計的產物長度在101～250bp之間，利用pcr驗證各基因擴增產物的長度，18個候選內參基因用於qrt-pcr分析的引物詳細信息見表1。通過凝膠電泳條帶(圖2)和qrt-pcr溶解曲線(圖3)評價引物特異性，電泳條帶單一且溶解曲線為單一峰的為合適的引物。各引物擴增效率分布範圍為77.9～118.1％之間，相關係數在0.995～0.999之間。
61.表1 18個候選基因的引物信息及pcr擴增效率
[0062][0063][0064]
(3)候選內參基因的表達穩定性評價
[0065]
通過qrt-pcr獲得18個候選內參基因在上述22個樣品中的ct值，即以上述cdna為模板，採用表1中的引物進行qpcr擴增，獲得ct值，三次重複；其中，actin1的平均ct值最低(21.45)，nadp-gpd的平均ct值最高(26.79)，各內參基因之間的轉錄水平存在明顯差異(圖4)。
[0066]
採用log
2fold change
方法計算22個樣本中18個基因的轉錄水平，其結果顯示候選基因在不同組織類型中的表達水平存在不規律性差異變化。因此，需繼續利用其它內參基因分析軟體候選內參基因表達穩定性。
[0067]
內參基因ct值在各樣本的平均標準差(mean standard deviation,msd)可以用於評價內參基因的穩定性，msd越低其穩定性越好，本研究中候選內參基因在不同組織中的穩定性排名見表2。
[0068]
表2δct對18個候選基因的穩定性評價
[0069]
排名不同材積msd不同組織msd全部msd1nadh10.28ef1-α10.54ef1-α10.552eif20.28ef1-α20.55eif20.573ef20.29ef20.57ef20.594ef1-α10.3cys0.58abctransporter20.595if20.31abctransporter20.59if20.596ubiquitin10.31ubiquitin10.6nadh10.597actin10.32eif20.6if-iia0.648ef1-α20.32if-iia0.62ubiquitin10.649ubiquitin20.33if20.62ubiquitin20.6410ef-1γ0.34nadh10.63cys0.6511abctransporter10.38actin10.67ef1-α20.6612abctransporter20.38ubiquitin20.68abctransporter10.6913if-iia0.39abctransporter10.7ef-ts0.6914gapdh10.42ef-ts0.71ef-1γ0.715cys0.43ef-1γ0.79actin10.7416ef-ts0.45gapdh11.18gapdh11.1817nadp-gpd0.57nadp-gpd1.45nadp-gpd1.2318actin20.64actin21.54actin21.73
[0070]
利用genorm軟體通過計算內參基因的表達穩定度m值來評估基因的表達穩定性，m值越小說明表達穩定性越高。結果顯示，eif2|nadh1(0.127)為不同材積木荷最適宜的內參基因組合(表3；圖5a)，ef1-α1|ef1-α2(0.158)為木荷不同組織最佳內參基因組合(表3；圖5b)，而eif2|if2(0.228)時全部樣本最適內參基因組合(表3；圖5c)。此外，通過genorm進一步分析結果顯示v2/v3在不同組織類型中均小於0.15，說明最適合歸一化的基因數量為2(圖5d、圖5e、圖5f)。
[0071]
表3基於genorm分析18個候選內參基因的穩定性
[0072][0073][0074]
利用normfinder軟體通過計算內參基因的表達穩定值(stability value,sv)篩選內參基因，sv越小說明穩定性越好。利用normfinder軟體對18個候選基因的穩定性進行分析(表4)，結果表明在不同材積木荷中nadh1排名第一(sv＝0.08)，actin2排名最後(sv＝0.594)；在不同組織中ef1-α1為最佳選擇(sv＝0.2)，actin2最不穩定(sv＝1.458)；ef1-α1在所有樣本中的表達穩定性最高(sv＝0.233)，actin2穩定性最低(sv＝1.668)。
[0075]
表4基於normfinder分析18個候選內參基因的穩定性
[0076]
排名不同材積sv不同組織sv全部sv1nadh10.08ef1-α10.2ef1-α10.2332eif20.114ef1-α20.218eif20.2833ef20.126cys0.233ubiquitin10.2924ef1-α10.148ef20.256abctransporter20.2945if20.161ubiquitin10.272nadh10.3276ubiquitin10.175abctransporter20.287ef20.3367actin10.187actin10.348if20.3368ubiquitin20.188eif20.381abctransporter10.3799ef1-α20.199if-iia0.386ef-ts0.38510ef-1γ0.211nadh10.393ef-1γ0.40811abctransporter10.268if20.395cys0.41212if-iia0.27ef-ts0.42if-iia0.41213abctransporter20.282abctransporter10.442ubiquitin20.41414gapdh10.332ubiquitin20.463actin10.43315cys0.339ef-1γ0.548ef1-α20.46716ef-ts0.368gapdh11.03gapdh11.03117nadp-gpd0.515nadp-gpd1.372nadp-gpd1.12318actin20.594actin21.458actin21.668
[0077]
利用bestkeeper軟體通過計算標準差(sd)和變異係數(cv)來評估基因的穩定性。一般來說，基因的穩定性由sd值決定，sd值越低其穩定性越好。結果如表5所示，bestkeeper對18個基因的穩定性分析結果顯示，ef1-α2適用於不同材積木荷，cys在不同組織及總樣本中穩定性最高，actin2在三種樣本組合中均表達最不穩定。
[0078]
表5基於bestkeeper分析18個候選內參基因的穩定性
[0079][0080][0081]
最後，利用reffinder軟體評估18個候選內參基因的穩定性。結果表明，nadh1和eif2在不同材積木荷中表達相對穩定(圖6a)，ef1-α1和ef1-α2在不同組織中是最合適的選擇(圖6b)，ef1-α1和eif2在總樣本中的穩定性優於其他基因(圖6c)。
[0082]
(4)目的基因驗證
[0083]
綜合各軟體分析結果選擇cys、nadh1、eif2、ef1-α1、ef1-α2等表達穩定的內參基因，以及表達最不穩定的actin2進行兩個目的基因sscsl1(seq id no.55)與sscsl2(seq id no.56)在上述22個樣本中的表達對比分析(利用excel計算基因在各樣本的平均值和標準差，並用柱形圖展示)，三次重複。其中，用於擴增sscsl1與sscsl2基因的引物序列如seq id no.57～60所示。
[0084]
結果如圖7所示：結果顯示，目的基因sscsl1與sscsl2在以actin2為內參基因進行分析時，其表達模式與其它內參基因存在明顯差異，表明cys、nadph1、eif2、ef1-α1、ef1-α2等內參基因具有明顯的優勢。
[0085]
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。