水稻品種對黑條矮縮病的敏感生育期及其在減輕病害危害上的應用的製作方法

2023-05-31 07:23:51 1

專利名稱：：水稻品種對黑條矮縮病的敏感生育期及其在減輕病害危害上的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及水稻品種對黑條矮縮病的敏感生育期及其在減輕病害危害上的應用，屬於農業科學
技術領域：
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背景技術：
：當嚴重影響長江下遊稻區的水稻條紋葉枯病基本被控制之際，同為灰飛蝨傳播的另一種水稻病毒病——水稻黑條矮縮病又發生流行危害，該病害是由水稻黑條矮縮病毒(Riceblack-streakeddwarfvirus，RBSDV)侵染水稻引發的，水稻一旦感病便無收穫。據統計，2007年水稻黑條矮縮病僅在江蘇省局部地區發生，危害面積30.8萬畝，至2008年已迅速在淮北、沿海和裡下河地區蔓延開，全省發病面積上升至400萬畝，其中僅病株率80%以上的絕收田塊面積就達3萬畝，按平均畝產500公斤初步估算約損失稻穀1.5億公斤，造成了糧食減產、農民減收，給農業生產帶來了巨大的損失，同時也嚴重挫傷了農民的種糧積極性。從植物病害流行學角度考察，水稻黑條矮縮病流行所需四大基本條件(豐富的毒源、大量的介體、大面積種植的感病品種和適宜的環境條件)已經具備，這與2001年水稻條紋葉枯病大爆發前夕所出現的徵兆十分相似，可以預見江蘇省乃至整個長江下遊稻區水稻黑條矮縮病在未來一段時間內具有特大爆發流行的風險性，這將對全國的糧食安全構成巨大威脅。在同為RBSDV引發的玉米粗縮病的綜合防治中，玉米對病害的成株期抗性的得到了很好的應用效果(採用調整播期方法使灰飛蝨發生期避開玉米敏感期的農業措施已取得非常好的防治效果)，這啟發我們在水稻黑條矮縮病的防治中同樣可以利用寄主對病原的成株期抗性，來減輕病害造成的危害。
發明內容本發明提供了水稻品種對黑條矮縮病的敏感生育期及其在減輕病害危害上的應用方法。本發明的原理是在明確水稻品種對水稻黑條矮縮病的敏感生育期的基礎上，在敏感生育期內通過防治減少病原的侵染概率，而在非敏感生育期則主要利用水稻品種對病原的成株期抗性，以達到更少的防治投入獲得更好防治效果的目的。在水稻品種對水稻黑條矮縮病的敏感生育期內採用減少病原的侵染概率，而在非敏感生育期則主要利用水稻品種對病原的成株期抗性。在上述方法中，「水稻品種對水稻黑條矮縮病的敏感生育期」是指水稻10葉齡之前；「物理、化學或栽培措施」是指秧苗期防蟲網覆蓋和適期防治灰飛蝨等防治手段；「利用水稻品種對病原的成株期抗性」是指在非敏感生育期不採取針對病原的防治措施。本發明提供了水稻品種對黑條矮縮病的敏感生育期及其在減輕病害危害上的應用方法。運用該方法在水稻黑條矮縮病的防治中，能夠以更少的防治投入獲得更好防治效果。具體實施方法實施例1，水稻品種對水稻黑條矮縮病敏感生育期①攜帶水稻黑條矮縮病毒的植株的獲得。2009年5月於江蘇邳州小麥重病區採集具有典型「綠矮」症狀的小麥。參照Trizol(Reagent)說明書方法提取小麥總RNA。根據已發表的RBSDV的S9序列設計引物(引物由上海英俊生物技術公司合成)R5'-GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3『Fl5'-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3『。採用RT-PCR檢測確定病株是否攜帶水稻黑條矮縮病毒。反轉錄按照M-MLV反轉錄酶(Promega)說明書進行。PCR擴增體系為cDNA模板3.OμL，Taqplus酶0.5yL，dNTP(每份10mmol.L-l)0.5yL，10XPCR緩衝液(含Mg2+)2.5μL，5，端引物(lOpmol.L-l)1.0yL，3，端引物(lOpmol.L-l)1.0μL,ddH2016.5μL，合計25μL。反應程序為95°C預變性5min；94°C變性Imin；51°C退火Imin；72°C延伸Imin；35個循環；最後72°C延伸10min，4°C保存，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增的目的條帶(1118bp)。同時採用斑點免疫結合法(DIBA)確定病株不攜帶水稻條紋病毒(Ricestripevirus,RSV)0挑選出6株僅含有水稻黑條矮縮病毒的小麥植株備用。②飼毒用灰飛蝨的獲得2008年4-5月從江蘇農科院小麥田中採集灰飛蝨若蟲，在感病品種武育粳3號上進行飼養，交配後單頭雌蟲單獨產卵，隨機抽取群體中10%的灰飛蝨採用斑點免疫結合法檢測雌蟲帶毒情況，保留不帶毒雌蟲的後代，以後每代次隨機抽取群體中10%的灰飛蝨採用斑點免疫結合法檢測確保不帶毒，即獲得不攜帶RSV的灰飛蝨。為避免傳毒介體汙染，每次飼毒前取100隻DIBA法檢測確定為無毒蟲(不攜帶RSV的灰飛蝨)。③灰飛蝨獲得病毒將篩選得到的病苗種於大燒杯中，土面覆蓋濾紙，將適量1-2齡無毒若蟲移入其中，並用紗布封口。飼毒2天後將蟲移入燒杯(中飼養預先育有武育粳3號秧苗)，13天後每批隨機取出30頭灰飛蝨，提取總RNA，方法如下取單頭灰飛蝨於2.OmL離心管，加300μLTrizol液搖動勻漿，室溫下放置lOmin，加入70μL的氯仿，按住管蓋劇烈搖蕩15sec，室溫放置2-3min，12000rpm離心15min，取上清液於一新離心管中，加入200μL的異丙醇(與上清等體積)，顛倒數次混勻；室溫放置lOmin，12000rpm離心lOmin，棄去上清液，再加入ImL75%酒精輕洗RNA沉澱，7500rpm離心5min，去上清，室溫乾燥5-lOmin，最後溶解在於10μLDEPC預處理的水中，保存於-20°C冰箱中。再採用①所述RT-PCR方法測定灰飛蝨帶毒率。④水稻品種對水稻黑條矮縮病敏感生育期的確定以水稻品種特特普和感病品種華粳6號為研究對象，將供試品種分期播種於試驗田育秧盤中，以便同時接種各個生育期水稻，待長至3-5葉齡後移栽於試驗田中，正常水肥管理，獲得葉齡期分別為2，4，6，8，10的健壯植株用於接蟲試驗(為保證秧苗不帶毒，接蟲前用無紡布罩於水稻苗上)。2-8葉齡的苗用兩頭開口玻璃管(直徑8cm，高45cm)罩住，10葉齡的苗用鐵圈支撐的紗網袋罩住，按8頭/苗的有效接種蟲量接入帶毒灰飛蝨(有效接種蟲量=接種蟲量X帶毒率)，用尼龍紗布將玻璃管頂端封閉，48小時後向玻璃管及紗網袋內噴適當濃度的吡蟲啉水溶劑滅蟲，3小時後取走玻璃管，鐵圈及紗網袋，每個處理5株苗，每個處理2個重複。正常水肥管理，30天後開始病害調查，每4天調查1次，直至完全顯症。症狀主要表現為植株矮化，葉片短闊、僵直，葉色深綠，葉背的葉脈和莖稈上初現蠟白色，後變褐色的短條瘤狀隆起。不同葉齡期水稻接種RBSDV後發病情況如表1，結果表明在本研究的接種強度下感病品種華粳6號8葉齡以內是其對RBSDV最敏感的時期，發病率明顯高於其他生育期。特特普6葉齡以內是其對RBSDV最敏感的時期，發病率也明顯高於其他生育期。華粳6號與特特普10葉齡均沒有發病。兩個品種都呈現出隨著接種葉齡增力口，對RBSDV敏感性降低的趨勢。接種水稻完全顯症後(2個月)，隨機選取12株水稻採用RT-PCR方法進行檢測，結果發現有典型發病症狀的植株均能擴增到目的條帶，無發病症狀的植株均不能擴增到目的條帶。上述結果表明水稻品種對水稻黑條矮縮病敏感生育期為水稻10葉齡以內。表1tableseeoriginaldocumentpage5實施例2，水稻品種對水稻黑條矮縮病敏感生育期在減輕病害危害上的應用以水稻品種特特普和感病品種華粳6號為研究對象，將供試品種播種於試驗田育秧盤中，3-5葉齡移栽，10葉齡前用無紡布罩於水稻苗上防止灰飛蝨傳播RBSDV。10葉齡時用鐵圈支撐的紗網袋罩住，按8頭/苗的有效接種蟲量接入帶毒灰飛蝨，用尼龍紗布將玻璃管頂端封閉，48小時後向玻璃管及紗網袋內噴適當濃度的吡蟲啉水溶劑滅蟲，3小時後取走玻璃管，鐵圈及紗網袋，每個處理5株苗，每個處理2個重複。正常水肥管理，30天後開始病害調查，每4天調查1次，直至完全顯症。症狀同實施例①。結果顯示特特普和華粳6號均未表現出水稻黑條矮縮病的症狀，隨機選取3株水稻採用RT-PCR方法進行檢測，均不能擴增到目的條帶。這表明在水稻品種對水稻黑條矮縮病的敏感生育期覆蓋防蟲網可以降低病害的發生和危害；而在非敏感生育期，較高的接種強度仍然不能使水稻發病，可以利用水稻自身的成株期抗性。本發明主要服務於水稻黑條矮縮病的防治，能夠以更少的防治投入獲得更好防治效果。上述實施不以任何形式限定本發明。權利要求水稻品種對黑條矮縮病的敏感生育期及其在減輕病害危害上的應用，其特徵在於在水稻品種對水稻黑條矮縮病的敏感生育期內採用物理、化學或栽培手段減少病原的侵染概率，而在非敏感生育期則主要利用水稻品種對病原的成株期抗性。2.1中所述「水稻品種對水稻黑條矮縮病的敏感生育期」是指水稻10葉齡之前；「物理、化學或栽培措施」是指秧苗期防蟲網覆蓋和適期防治灰飛蝨等防治手段。全文摘要本發明提供了水稻品種對黑條矮縮病的敏感生育期及其在減輕病害危害上的應用方法。在明確水稻品種對水稻黑條矮縮病的敏感生育期的基礎上，在敏感生育期內通過防治減少病原的侵染概率，而在非敏感生育期則主要利用水稻品種對病原的成株期抗性，以達到更少的防治投入獲得更好防治效果的目的。將本發明應用於水稻黑條矮縮病的防治，既可以節省防治成本，又可以提高防治效率，還可以減少過度化學防治帶來的環境汙染。文檔編號A01G16/00GK101822188SQ201010164250公開日2010年9月8日申請日期2010年5月6日優先權日2010年5月6日發明者吳麗娟,周彤,周益軍,程兆榜申請人:江蘇省農業科學院