用於酶促過酸生產的過水解酶的製作方法
2023-05-30 12:20:51
專利名稱：用於酶促過酸生產的過水解酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及過氧羧酸生物合成和原位酶催化領域。具體地講，提供使用酶催化劑製備過氧羧酸的方法，所述酶催化劑包含與來自乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcuslactis subsp. Iactis)的乙醯木聚糖酯酶具有同一丨丨生的酶催化劑。
背景技術：
過氧羧酸組合物可為有效的抗微生物劑。已經描述了使用過氧羧酸清潔、滅菌和/或消毒硬質表面、織物、肉製品、活植物組織和醫療器械以殺滅不良微生物生長的方法(美國專利公開6，545，047 ;美國專利公開6，183，807 ;美國專利公開6，518，307 ;美國專利公 開申請公布20030026846 ;和美國專利公開5，683，724)過氧羧酸也已經在多種衣物洗滌護理應用中使用，例如它們用作漂白劑(美國專利公開3，974，082 ;美國專利公開5，296，161 ；和美國專利公開5，364，554)。過氧羧酸可通過羧酸烷基酯和過氧化物試劑如過氧化氫(參見OrganicPeroxides, Daniel Swern 編輯，第 I 卷，第 313-516 頁；ffiley Interscience, New York,1971)的化學反應來製備。然而，在輕度鹼性至酸性pH(約8至約4)下，所述反應進行的速度通常不足以產生適合多種商業消毒和/或漂白應用的過氧羧酸濃度。克服過氧羧酸化學法製備缺點的一種方法是使用具有過水解活性的酶催化齊U。授予DiCosimo等人的美國專利公開申請11/638，635和美國專利公開申請公布2008/0176783 ；2008/0176299 ；以及 2009/0005590 公開了結構上歸類為糖酯酶 CE-7 家族的成員的酶(例如先鋒黴素C脫乙醯酶[CAH]和乙醯木聚糖酯酶[AXE])，它們特徵在於將羧酸酯(在合適的過氧來源如過氧化氫的存在下)轉化成濃度足以用作消毒劑和/或漂白劑的過氧羧酸的顯著過水解活性。糖酯酶CE-7家族的一些成員已顯示具有過水解活性，一旦反應組分混合，其活性足以在I分鐘內從醇、二醇和甘油的乙醯基酯中產生4000_5000ppm過乙酸，以及在5分鐘至30分鐘內產生至多9000ppm過乙酸(DiCosimo等人，美國專利申請公開2009/0005590)。通常，在包括過量底物，pH約6. 0至約8. 5和合適的溫度範圍內的合適含水反應條件下，在30分鐘或更長時間後CE-7過水解酶將產生濃度提高的過酸。通常使用有效量的至少一種緩衝液保持反應pH。使用此類條件產生的過氧乙酸量可能超出期望的量或者可能花費時間太長而不能最終達到某些應用的有效濃度。過氧羧酸(例如過乙酸)的酶促生產通常使用含水反應條件進行。同樣地，水解反應(化學的和/或酶促的)通常通過水解酯底物和/或水解過氧羧酸產生相應的羧酸(例如乙酸)，從而破壞所需的產物。酶促過水解(過氧羧酸或過氧羧酸與相應的羧酸水解產物的混合物)的產物可腐蝕某些金屬表面。同樣地，可能期望限制反應期間產生的過氧羧酸總量以防止或最小化所得溶液的腐蝕效應。例如，需要在I分鐘內產生不超過200ppm至IOOOppm過酸的應用通常使用產生的過酸最終濃度遠高於這些限制的反應條件。在原位生成用於消毒硬質表面的過酸的應用中，希望具有快速生成不顯著超過有效消毒劑濃度上限的期望濃度過酸的能力，從而限制或防止表面某些組分的腐蝕。在原位生成用於漂白衣物或織物的過酸的應用中，也期望對生成的高於漂白所需過酸的濃度進行類似的限制。同樣地，需要提供快速製備期望的「目標」濃度的過氧羧酸的方法，尤其是在過量底物的存在下更是如此。當pH下降至低於約6. 0時，多種CE-7糖酯酶表現出過水解活性的降低或滅活，大多數CE-7過水解酶在等於或低於pH5. 0時被滅活。授予DiCosimo等人的美國專利公開申請12/539，025提出了通過選擇反應組分和從 而形成反應產物的條件(即過氧羧酸和對應的羧酸水解產物)製備期望「目標」濃度的過氧羧酸的方法，所述條件將反應混合物的PH降低至其中酶催化劑具有極低或無過水解活性的值。選擇反應組分和條件從而在10分鐘或更短時間內將反應混合物的PH降至低於6. 0，使得人們能夠控制產生的過氧羧酸濃度。然而，pH小於6.0的產物混合物可能不是一些消毒和/或漂白應用所期望的，尤其是當接觸反應產物的表面易於腐蝕和漂白過度時更是如此。在此類環境下，需要控制酶促產生的過氧羧酸的量，所述過氧羧酸不依賴反應混合物PH的大幅下降。需解決的問題是提供酶促製備在含水反應混合物中的期望濃度的過氧羧酸的方法，所述反應混合物不依賴顯著降低的PH或低於6. 0的pH。選擇的反應組分和反應條件應能夠快速產生期望的過氧羧酸，其濃度一旦達到目標濃度不再顯著提高。發明概述已經通過發現在5分鐘或更短時間內製備期望濃度的過氧羧酸的酶促方法解決了所述問題，所述酸濃度一旦達到期望濃度基本上不再提高；其中反應混合物的PH在反應期間保持在6. 0和9. 0之間。所述方法包括使用包含具有過水解活性的酶的酶催化劑，所述酶與來自乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis)的乙醯木聚糖酯酶具有至少95%的同一性。本發明的酶催化劑能夠在5分鐘或更短時間內快速產生具有基本上穩定的目標濃度的過氧羧酸的產物混合物，甚至在過多底物的存在下和PH6. 0至9. 0的範圍內依然如此；所述條件下其他CE-7過水解酶通常在5分鐘或更長時間後產生濃度顯著提高的過氧羧酸。在一個實施方案中，提供了製備目標濃度的過氧羧酸的方法，包括a)選擇一組反應組分,所述反應組分包含I)至少一種底物，所述底物選自i)具有以下結構的酯[XJmR5其中；X =式 R6-C(O)O 的酯基；R6 = C1-C7直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代，其中當R6 = C2-C7時，R6任選地包含一個或多個醚鍵；R5 = C1-C6直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地被羥基取代；其中R5中的每個碳原子各自包含不超過一個輕基或不超過一個酯基；其中R5任選地包含一個或多個醚鍵；m = I至R5中的碳原子數目；並且其中在25°C下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；ii)具有以下結構的甘油酯
權利要求
1.製備目標濃度的過氧羧酸的方法，包括 (a)選擇一組反應組分,所述反應組分包含 (I)至少一種底物，所述底物選自 (1)具有以下結構的酯 [XlmR5 其中 X =SR6-C(O)O 的酯基； R6 = C1-C7直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代，其中當R6 = C2-C7時，R6任選地包含一個或多個醚鍵； R5 = C1-C6直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地被羥基取代；其中R5中的每個碳原子各自包含不超過一個輕基或不超過一個酯基；其中R5任選地包含一個或多個醚鍵； Hl = I至&中的碳原子數目；並且 其中在25°C下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度； ( )具有以下結構的甘油酯
2.權利要求I的方法，其中在等於或大於混合所述反應組分後30分鐘的反應時間，在混合所述反應組分後一分鐘產生的過氧羧酸濃度的增加不超過100%。
3.權利要求I的方法，其中在等於或大於混合所述反應組分後五分鐘的反應時間，在混合所述反應組分後一分鐘產生的過氧羧酸濃度的增加不超過50%。
4.權利要求3的方法，其中在等於或大於混合所述反應組分後五分鐘的反應時間，在混合所述反應組分後一分鐘產生的過氧羧酸濃度的增加不超過20%。
5.權利要求I的方法，其中通過所述方法產生的過氧羧酸總量不受所述反應混合物中的底物量或過氧量的限制。
6.權利要求I的方法,其中所述反應混合物的pH範圍為約6.5至約8. 5。
7.權利要求6的方法，其中所述反應混合物的pH範圍為約7.O至約8. O。
8.權利要求I的方法，其中所述反應混合物包含至少一種緩衝液。
9.權利要求8的方法，其中所述至少一種緩衝液選自碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉和碳酸氫鉀的混合物、磷酸鈉、磷酸鉀、以及磷酸鈉和磷酸鉀的混合物。
10.權利要求I的方法，其中所述底物選自甘油一乙酸酯；甘油二乙酸酯；甘油三乙酸酯；甘油一丙酸酯；甘油二丙酸酯；甘油三丙酸酯；甘油一丁酸酯；甘油二丁酸酯；甘油三丁酸酯；葡萄糖五乙酸酯；木糖四乙酸酯；乙醯化木聚糖；乙醯化木聚糖片段；β-D-呋喃核糖-I，2，3，5-四乙酸酯；三-鄰-乙醯基-D-半乳醛；三-鄰-乙醯基-葡萄烯糖；I，2-乙二醇；1，2-丙二醇；1，3-丙二醇；1，2_ 丁二醇；1，3-丁二醇；2，3_ 丁二醇；1，4_ 丁二醇；1，2_戊二醇；2，5_戊二醇；1，6_戊二醇；1，2-己二醇；2，5-己二醇；1，6-己二醇的單酯或二酯；丙二醇二乙酸酯；乙二醇二乙酸酯；以及它們的混合物。
11.權利要求I的方法，其中所述產生的過氧羧酸為過乙酸、過丙酸、過丁酸、過乳酸、過乙醇酸、過甲氧基乙酸、過-β -羥基丁酸、或它們的混合物。
12.權利要求I的方法，其中所述酶催化劑為微生物細胞、透化的微生物細胞、微生物細胞提取物、部分純化的酶或純化的酶的形式。
13.權利要求I的方法，其中所述酶催化劑缺乏過氧化氫酶活性。
14.權利要求I的方法，還包括以下步驟(c)使表面或無生命的物體與步驟(b)中產生的過氧羧酸接觸，從而將所述表面或所述無生命的物體消毒、脫色、除臭或漂白。
15.權利要求I的方法，還包括以下步驟(c)使織物與步驟(b)中產生的過氧羧酸接觸，從而所述織物獲得有益效果。
16.權利要求15的方法，其中所述有益效果選自消毒、漂白、脫色、除臭、以及它們的任何組合。
17.製備目標濃度的過氧羧酸的方法，包括 (a)選擇一組反應組分,所述反應組分包含 (I)至少一種底物，所述底物選自 (i)具有以下結構的酯 [XlmR5 其中 X =SR6-C(O)O 的酯基； R6 = C1-C7直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代，其中當R6 = C2-C7時，R6任選地包含一個或多個醚鍵； R5 = C1-C6直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地被羥基取代；其中R5中的每個碳原子各自包含不超過一個輕基或不超過一個酯基；其中R5任選地包含一個或多個醚鍵；Hl = I至&中的碳原子數目；並且 其中在25°C下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度；(ii)具有以下結構的甘油酯
18.權利要求17的方法，其中在等於或大於混合所述反應組分後30分鐘的反應時間，在混合所述反應組分後五分鐘產生的過氧羧酸濃度的增加不超過50%。
19.權利要求18的方法，其中在等於或大於混合所述反應組分後30分鐘的反應時間，在混合所述反應組分後五分鐘產生的過氧羧酸濃度的增加不超過20%。
20.組合物，包含 (a)—組反應組分,所述反應組分包含 (I)至少一種底物，所述底物選自 (i)具有以下結構的酯 [XlmR5 其中 X =SR6-C(O)O 的酯基； R6 = C1-C7直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代，其中當R6 = C2-C7時，R6任選地包含一個或多個醚鍵； R5 = C1-C6直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地被羥基取代；其中R5中的每個碳原子各自包含不超過一個輕基或不超過一個酯基；其中R5任選地包含一個或多個醚鍵； Hl = I至&中的碳原子數目；並且 其中在25°C下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度； (ii)具有以下結構的甘油酯
21.權利要求20的組合物，其中所述酶催化劑包含具有胺基酸序列SEQID N0:4的酶。
22.試劑盒，包括 (a)第一隔室，所述第一隔室包含(1)酶催化劑，所述酶催化劑包含與SEQID NO :4具有至少95%的胺基酸同一性的酶； (2)至少一種底物，所述底物選自 (i)具有以下結構的酯 [XlmR5 其中 X =SR6-C(O)O 的酯基； R6 = C1-C7直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代，其中當R6 = C2-C7時，R6任選地包含一個或多個醚鍵； R5 = C1-C6直鏈、支鏈或環狀烴基部分，其任選地被羥基取代；其中R5中的每個碳原子各自包含不超過一個輕基或不超過一個酯基；其中R5任選地包含一個或多個醚鍵； Hl = I至&中的碳原子數目；並且 其中在25°C下所述酯具有至少5ppm的水中溶解度； (ii)具有以下結構的甘油酯OR1-C-O-CH2-CH-CH2-OR4 OR3 其中R1 = C1-C7直鏈或支鏈烷基，其任選地被羥基或C1-C4烷氧基取代，並且R3和R4各自為H或R1C(O);和 (iii)選自乙醯化單糖、乙醯化二糖和乙醯化多糖的乙醯化糖；和(3)任選的緩衝液；和(b)第二隔室，所述第二隔室 包含(1)過氧源；(2)過氧化物穩定劑；和(3)任選的緩衝液。
全文摘要
本發明提供了從羧酸酯中快速製備目標濃度的過氧羧酸的方法。更具體地講，羧酸酯在酶催化劑的存在下與過氧源如過氧化氫反應，所述酶催化劑包含與來自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的具有過水解活性的乙醯木聚糖酯酶具有同一性的酶。多肽為結構上歸類為糖酯酶家族7(CE-7)成員的酶。通過本發明方法製備的過氧羧酸可用於消毒、漂白和其他衣物洗滌護理應用。本發明也提供了包含所述反應組分的組合物和通過所述方法製備的過氧羧酸。
文檔編號C12P7/40GK102782143SQ201080054802
公開日2012年11月14日 申請日期2010年9月29日 優先權日2009年10月1日
發明者J·E·加瓦根, M·S·佩恩, R·迪科西莫 申請人:納幕爾杜邦公司