丹酚酸b的用途的製作方法

2023-06-14 21:38:31

專利名稱：丹酚酸b的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及丹參提取物的用途，尤其涉及丹酚酸B的用途。
背景技術：
丹酚酸B (Salvianolic acid B, Sal B)是一種具有如式I所示的母核結構的化合物，別名丹參酚酸B，它可提取於唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)的乾燥根，是棕黃色乾燥粉末；味微苦、澀；可溶於水，乙醇、甲醇
基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMP)是一類結構中含Zn2，BCa2+的蛋白水解酶類，主要參與細胞外基質的代謝。它們在血管形成、傷口癒合、腫瘤浸潤和纖維化等方面起著重要的作用，因此備受關注。
目前已發現的基質金屬蛋白酶已經超過14種，主要分為五類間質膠原酶類，可降解間質膠原(I、 II 、 III型膠原)，包括應P-1、 MMP-8和麗P-3;另一類為IV型膠原酶/明膠酶等，可降解基底膜IV型膠原和變性的間質膠原(明膠)，包括MMP-2和MMP-9;第三類為基質分解素類，可降解蛋白多糖、層粘連蛋白、纖維連接蛋白和IV型膠原，包括醒P-3、 MMP-7和MMP-10;第四類為膜型金屬蛋白酶類(membrane-type MMP3， MT-MMPs)，它包括MMP-14、 MMP-15、MMP-16和MMP-17。膜型金屬蛋白酶類有雙重功效激活MMP2酶原(proMMP2)，降解細胞外基質；第五類包括MMP-11和麗P-12。
對於丹酚酸B的研究顯示它具有削弱腿Ps上調的作用，可通過抑制MMP-2和MMP-9蛋白合成及下調ERKl/2和JNK削弱LPS誘導的細胞遷移；丹酚酸B
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5還可以抑制TNF-a誘導的MMP-2 mRNA蛋白表達和抑制HASMCs中的液化明膠活 性；研究還顯示，丹酚酸B對腿P-2、MMP-13的活性沒有影響，但能誘導MMP-13 的活性和上調MMP-2的基因表達。
但是還沒有研究顯示丹酚酸B是一種新型的MMP-9抑制劑，因此本領域迫 切需要了解這些以及丹酚酸B影響心臟功能的進一步機制。

發明內容
本發明旨在提供一種具有如式I所示的母核結構的化合物的用途。 本發明的另一個目的是提供一種篩選具有抑制MMP-9酶活性的物質的方法。
在本發明的第一方面，提供了一種具有如式I所示的母核結構的化合物在制 備MMP-9酶抑制劑中的用途
在另一優選例中，所述的具有如式I所示的母核結構的化合物如式II所示:
formula see original document page 6
其中，R選自烴基、羥基、醚類、醛基、酮基、羧基、或醯基。 在另一優選例中，R選自羥基或羧基。
在另一優選例中，所述的具有如式I所示的母核結構的化合物如式III所示:在另一優選例中，所述的抑制劑用於改善與MMP-9酶活性相關的左心室收縮 能力，或用於改善與MMP-9酶活性相關的心肌損傷和/或心臟功能。
在另一優選例中，所述的抑制劑含有1一99. 9wt^的具有如式I所示的母核結 構的化合物。
在本發明的第二方面，提供了一種具有如式I所示的母核結構的化合物在制 備通過抑制MMP-9酶活性改善左心室收縮能力，或改善心肌損傷和/或心臟功能的 組合物中的用途
在另一優選例中，所述的具有如式I所示的母核結構的化合物如式II所示 formula see original document page 7其中，R選自烴基、羥基、醚類、醛基、酮基、羧基、或醯基；優選R選自羥 基或羧基；更優選所述的具有如式I所示的母核結構的化合物如式III所示在本發明的第三方面，提供了一種篩選具有抑制MMP-9酶活性的物質的方
法，所述的方法包括步驟
(a) 將具有如式I所示的母核結構的化合物和MMP-9混合得到對照物，將 待篩物質和MMP-9混合得到待檢物；
(b) 將步驟(a)得到的待檢物和對照物進行羅P-9酶活性檢測；和
(c) 待檢物的MMP-9酶活性低於或等於對照物的MMP-9酶活性，表明待篩 物質能抑制MMP-9酶活性。
在另一優選例中，具有如式I所示的母核結構的化合物如式II所示
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其中，R選自烴基、羥基、醚類、醛基、酮基、羧基、或醯基；優選R選自羥
基或羧基；更優選所述的具有如式I所示的母核結構的化合物如式III所示
0


圖1顯示了計算機模擬的丹酚酸B與MMP-9的晶體結構對接的情況；其中 A為丹酚酸B的化學結構式，B為丹酚酸B的三維結構式；C為丹酚酸B與
醒P-9的對接圖；D為丹酚酸B與MMP-9具有空間結合位點圖。 圖2顯示了丹酚酸B對MMP-9酶活性的直接抑制作用；其中 A是醒P-9和MMP-2的蛋白電泳圖，B是MMP-9和MMP-2酶活性抑制率的
柱狀圖。
圖3顯示了丹酚酸對腿P-2和麗P-9酶活性的影響；其中 A是不同實驗組的MMP-9和腿P-2的蛋白電泳圖，B是不同實驗組的MMP-9 和MMP-2酶活性柱狀圖。
圖4顯示了 H&E染色的大鼠心臟組織在顯微鏡下的情況。
具體實施例方式
發明人經過廣泛而深入的研究，意外地發現丹酚酸B與MMP-9具有空間對 接位點，它可直接抑制MMP-9的酶活性，從而改善血流動力學指標，並減少心 肌的丙二醛和肌酸激酶水平，因此丹酚酸B可以提高左心室的收縮能力，從而 可用於改善心功能。
丹酚酸B是具有如式I所示的母核結構的化合物，發明人發現這種結構的 母核可以嵌入具三維構象的腿P-9中完成與其的空間對接。
如本文所用，術語"具有如式I所示的母核結構的化合物"是以式I所示結 構為母核的化合物或含有50 — 99.9wtM的以式I所示結構為母核的化合物的混合 物(如植物提取物)，優選含65 — 99.9wt%，更優選含95-99.9wt%;這種結構的 化合物可以在體外或體內同具三維構象的MMP-9進行對接，抑制MMP-9的酶活性
在一個優選例中，所述的具有如式I所示的母核結構的化合物如式II所示:
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ilIA 「 ■、, 0、,、z、,kformula see original document page 10其中，R選自烴基、羥基、醚類、醛基、酮基、羧基、或醯基。較佳地，R選自羥基或羧基；更佳地，所述的具有如式I所示的母核結構的化合物是如式ni所示的丹酚酸B (Salvianolic acid B， Sal B):
III
如本文所用，術語"丹酚酸B (Salvianolic acid B， Sal B)"是如式III的化合物或含有50 — 99.9wty。的如式III化合物的混合物(如植物提取物)，優選含65 — 99. 9wt%，更優選含95-99. 9wt% 。
如本文所用，術語"抑制劑"是指可抑制MMP-9酶活性的具有如式I所示的母核結構的化合物，也可以是以具有如式I所示的母核結構的化合物為活性成分或功效成分的組合物。
用途
本發明提供了一種具有如式I所示的母核結構的化合物的用途，就是將其用於抑制應P-9酶活性。可以將具有如式I所示的母核結構的化合物單獨使用，也可將其作為抑制醒p-9酶活性的組合物中的功效成分。
組合物中所述的具有如式I所示的母核結構的化合物可以選自如式II所示的
一組化合物R M V"
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其中，R選自烴基、羥基、醚類、醛基、酮基、羧基、或醯基；較佳地，R 選自羥基或羧基；更佳地，所述具有如式I所示的母核結構的化合物是丹酚酸 B。
組合物中的活性成分除了上述的化合物，還可以含有有助於抑制醒P-9酶 活性的額外組分，例如丹酚酸A、紫草酸等。
本發明具有如式I所示的母核結構的化合物還可用作改善左心室收縮能力
的組合物中的活性成分。
本發明的組合物中還可以包括其它具有改善左心室收縮能力的物質。
本發明具有如式I所示的母核結構的化合物還可用作改善心功能的組合物 中的活性成分。
本發明的組合物中還可以包括其它具有改善心功能的物質。
在本發明中，各種組合物可以按本領域熟知的方法配製，可以將活性成分 與常規的賦形劑、調味劑、崩解劑、防腐劑、潤滑劑、溼潤劑、粘合劑、溶劑、 增稠劑或增溶劑等藥物輔料混合，製成任何一種適合於臨床使用的劑型，如粉 劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑、口服液體製劑等。
所述的組合物可以是藥物組合物、食品組合物或保健品組合物。
所述的組合物包括(a)丹酚酸B;和(b)食品學上或藥學上可接受的載體。 所述的組合物選自(i)粉劑、顆粒劑、膠囊劑、注射劑、酊劑、口服液、
片劑或含片；或(ii)飲料或酒類。
在將本發明提供的具有如式I所示的母核結構的化合物或其組合物用於抑 制MMP-9酶活性時，可以向需要者施用有效成分每日0. 01-5克/60千克體重， 更佳地為0. 1-2. 0克/60千克體重。
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11本發明還提供一種篩選可抑制MMP-9酶活性的物質的方法，它包括步驟
(a) 將具有如式I所示的母核結構的化合物和MMP-9混合得到對照物，將 待篩物質和羅P-9混合得到待檢物；
(b) 將步驟(a)得到的待檢物和對照物進行MMP-9酶活性檢測；
(c) 待檢物的MMP-9酶活性低於或等於對照物的MMP-9酶活性，表明待篩 物質能抑制MMP-9酶活性。
所述的具有如式I所示的母核結構的化合物可以選自如式II所示的一組化合
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其中，R選自烴基、羥基、醚類、醛基、酮基、羧基、或醯基；較佳地，R 選自羥基或羧基；更佳地，所述具有如式I所示的母核結構的化合物是丹酚酸 B。
可以使用本領域常規的方法檢測MMP-9酶活性，例如但不限於明膠酶譜 檢測，MiniBis系統定量檢測。
本發明還提供了一種製備與MMP-9酶活性有關的疾病的診斷劑中的用途。
所述的疾病包括心臟病。
所述的具有如式I所示的母核結構的化合物可以選自如式n所示的一組化合
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其中，R選自烴基、羥基、醚類、醛基、酮基、羧基、或醯基；較佳地，R 選自羥基或羧基；更佳地，所述具有如式I所示的母核結構的化合物是丹酚酸
12B。
本發明提到的上述特徵，或實施例提到的特徵可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特徵可與任何組合物形式並用，說明書中所揭示的各個特徵，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特徵取代。因此除有特別說明，所揭示的特徵僅為均等或相似特徵的一般性例子。
本發明的主要優點在於-
1、 首次發現具有如式I所示的母核結構的化合物與羅P-9可以進行空間
對接，從而抑制畫P-9酶活性；
2、 提示可以通過對如式I所示的母核結構進行改造得到有效抑制MMP-9酶活性的物質；
3、 建立了一種以具有如式I所示的母核結構的化合物作為參照的篩選MMP-9酶活性抑制劑的方法。
下面將結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數按重量計。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。
實施例1
計算機模擬丹酚酸B與MP-9具有對接位點
首先利用hyperchem 7. 5建立了酚酸B的分子模型，並進行了初步的優化。後使用guassian 03 C (量化軟體)，採用混合泛函B3LYP方法選擇6-31G(d)基組，對丹酚酸B分子進行了精確的結構優化。然後利用分子對接軟體molsoftICM pro 3.5，進行丹酚酸B與MMP-9(編號1GKC，只保留晶體結構中的一條蛋白鏈，其它刪除)晶體結構的對接。
1320
結果見圖l。 A為丹酚酸B的化學結構式。B為丹酚酸B的三維結構式。C 為丹酚酸B與MMP-9的對接圖。D為丹酚酸B與MMP-9具有空間結合位點圖。
上述結果表明，丹酚酸B可嵌入MMP-9的空間構像中，且結合位點與目前 已知的抑制劑非常近似。
實施例2
明膠酶譜檢測丹酚酸B直接抑制MMP-9活性(體外)
急性心肌梗死後可引起MMP-9酶活性的快速上調，隨後出現MMP-2活性上 調。因此本研究將急性心肌梗死大鼠缺血區組織作為MMP-9及醒P-2的蛋白酶 來源。
將大鼠心臟缺血區域的組織在冷PBS溶液中勻漿，4°C條件下3000g離心 IO分鐘，上清液通過Lowry法進行蛋白定量。
20pg蛋白在含1%明膠的10% SDS-PAGE上電泳。
2% Triton X-100水洗1小時，在37°C條件下孵育24小時，孵育液為分 別含100 M， 200 M，和400 M丹酚酸B緩衝液(50mM Tris-HC1， 5mM CaC12， 和150mM NaCl(pH7. 5)，無丹酚酸的孵育液作為對照。
最後通過0. 1%考馬斯亮藍染色，10%甲醇，5%乙酸脫色，麗P-9活性通過 MiniBis系統進行定量。
結果見圖2。經過24小時的孵育，100 M丹酚酸B明顯降低MMP-9活性 (86. 0%)，在同一條件下丹酚酸B對MMP-2抑制率達到201隨著濃度的增高， 丹酚酸B對兩種蛋白酶活性的抑制作用逐漸增強。 結果表明，丹酚酸B對MMP-9具有選擇性抑制作用。
實施例3
220—250g Wistar大鼠購自中科院上海實驗動物中心，通過結紮大鼠冠狀 動脈左降支製備急性心肌梗死動物模型。
實驗分成四組模型組(AMI)，假手術組(Sham)，假手術丹酚酸組(SA-sham), 模型丹酚酸組(SA-AMI)。
丹酚酸為灌餵給藥，每次60mg/kg，於模型製備前三天開始給藥，每天一次。 模型製備後24小時取梗死區組織(假手術組取對應部位心肌組織)進行勻漿， 4°C條件下3000g離心10min，取上清液。Lowry法蛋白定量。
14分別取各組大鼠心肌組織蛋白20 g在含1%明膠的SDS-PAGE上進行電泳。2%Triton X-100水洗1小時，在37°C條件下孵育24小時，孵育液為(50mMTris-HCl， 5mM CaC12，和150mM NaCl (pH7. 5)，最後通過0. 1%考馬斯亮藍染色，10%甲醇，5%乙酸脫色，MMP-9活性通過MiniBis系統進行定量。
結果見圖3。 *表示與假手術組比較具有差異(*P<0.05,***p<0.01) ;tt表示與模型組比較具有差異(ttp<0. 05，#,<0. 01)。
結果表明，丹酚酸(每克含650毫克丹酚酸B)可顯著抑制急性心肌梗死所誘發的腿P-9酶活性升高，但對MMP-2未表現出明顯調節作用。
實施例4
採用與實施例3同樣的實驗動物模型，實驗分組和藥物處理方法。實驗取材時將各組大鼠的心臟用中性多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 m切片，採用蘇木素-伊紅染色，觀察丹酚酸(每克含650毫克丹酚酸B)對心肌組織的保護作用。
結果見圖4。
結果表明，丹酚酸明顯改善急性梗死大鼠的心臟結構，較模型組相比心肌細胞形態明顯改善。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
1權利要求
1. 一種具有如式I所示的母核結構的化合物在製備MMP-9酶抑制劑中的用途
2.如權利要求1所述的用途，其特徵在於， 構的化合物如式II所示formula see original document page 2所述的具有如式i所示的母核結formula see original document page 2其中，R選自烴基、羥基、醚類、醛基、酮基、羧基、或醯基。
3. 如權利要求2所述的用途，其特徵在於，R選自羥基或羧基。
4. 如權利要求2所述的用途，其特徵在於，所述的具有如式I所示的母核結 構的化合物如式III所示formula see original document page 2III
5.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的抑制劑用於改善與MMP-9 酶活性相關的左心室收縮能力，或用於改善與MMP-9酶活性相關的心肌損傷和/或 心臟功能。
6. 如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的抑制劑含有l一99.9wt^的具有如式I所示的母核結構的化合物。
7. 一種具有如式i所示的母核結構的化合物在製備通過抑制MMP-9酶活性改善左心室收縮能力，或改善心肌損傷和/或心臟功能的組合物中的用途formula see original document page 3
8.如權利要求7所述的用途，其特徵在於，所述的具有如式I所示的母核結構的化合物如式n所示formula see original document page 3ii其中，R選自烴基、羥基、醚類、醛基、酮基、羧基、或醯基；優選R選自羥基或羧基；更優選所述的具有如式I所示的母核結構的化合物如式III所示formula see original document page 3III
9.一種篩選具有抑制MMP-9酶活性的物質的方法，其特徵在於，所述的方法包括步驟(a)將具有如式I所示的母核結構的化合物和MMP-9混合得到對照物，將待篩物質和MMP-9混合得到待檢物；(b) 將步驟(a)得到的待檢物和對照物進行麗P-9酶活性檢測；和(c) 待檢物的麗P-9酶活性低於或等於對照物的MMP-9酶活性，表明待篩物質能抑制MMP-9酶活性。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，具有如式I所示的母核結構的化合物如式II所示formula see original document page 4其中，R選自烴基、羥基、醚類、醛基、酮基、羧基、或醯基；優選R選自羥基或羧基；更優選所述的具有如式I所示的母核結構的化合物如式III所示
全文摘要
本發明公開了一種具有如式I所示的母核結構的化合物在製備MMP-9酶活性抑制劑中的用途。本發明還公開了一種篩選具有抑制MMP-9酶活性的物質的方法。
文檔編號A61P9/00GK101496798SQ20081003346
公開日2009年8月5日 申請日期2008年2月2日 優先權日2008年2月2日
發明者姜寶紅, 果德安 申請人:中國科學院上海藥物研究所