天然金絲桃素抗病毒新藥的製作方法

2023-06-08 05:56:11 2

專利名稱：：天然金絲桃素抗病毒新藥的製作方法
技術領域：
：本發明所涉及的是一種以目前市場所售的普通貫葉連翹提取物為原料，從中提取得到高含量的金絲桃素hypericin,並且活性可測成份^30%-100%。(二)
背景技術：
：貫葉連翹提取物是目前繼銀杏葉提取物之後的國外廠商所青睞的產品之一。在國外用做抗抑鬱藥已有百餘年歷史。而金絲桃素(hypericin)是貫葉連翹提取物中抗病毒的主要活性成份。近年來隨著對貫葉連翹在抗病毒、抗癌、抗抑鬱機制等方面的研究深入，使其成為當前匯集研究開發熱點課題之一。為此，貫葉連翹提取物的活性成份的提取和純化工藝也普遍受到大家的關注。目前國內主要有醇提法、鹼水提。以乙醇為溶劑提取金絲桃素(hypericin)是比較常規的方法，但提取物中金絲桃素(hypericin)含量受提取條件影響很大，且提取物易吸溼粘結成塊，通過加除雜劑、調ra值等解決了產品的吸溼性，但是產品中金絲桃素(hypericin)的含量只有0.7%，金絲桃素基本上被破壞。如果使用大孔樹脂或溶劑等手段進行精製分離，雖然能得到含量較高的有效成分提取物，但成本太高，耗時相當長，作為普通的提取物乾粉其生產成本難以被市場接受。也有報導，在實驗室理，金絲桃素含量提高到28%，但無法工藝化。本發明是通過自創的分子捕獲技術有效的富集金絲桃素成份，使金絲桃素含量(hypericin)>30%-100%。(三)
發明內容本發明是以市場上銷售的天然植物貫葉連翹為提取原料，用自創的分子捕獲技術提取到的含量為30%_100%天然金絲桃素。這個天然的含量為30%_100%金絲桃素有抗病毒效果，這樣的金絲桃素對廣譜的病毒有殺滅作用，並且去除了金絲桃素光敏副作用。分子結構OHOOHHOOOH本發明天然金絲桃素的提取方法包括以下步驟(1)稱取一定量的貫葉連翹提取物，(1020)倍量的(1%5%)二乙醇胺水溶液使溶解，溶液通過濾布(100400目)過濾，以此避光。(2)濾液以一定的流速通過吸附柱(cht30)，然後依次以(1020)倍量水、30.1%0.5%純鹼溶液衝洗吸附柱(cht30)，直至純鹼洗脫下來的溶液在350nm處的吸收度《0.3，純鹼溶液衝洗完畢後，又依次再加(1020)倍量(0.5%1.5%)檸檬酸溶液、(1020)倍量水、(1530)倍量的(70%80%)乙醇溶液衝洗柱子，棄去洗脫液。(3)以(1530)倍量0.5%二乙醇胺乙醇(80%乙醇)溶液洗脫金絲桃素，收集金絲桃素洗脫液。(4)金絲桃素洗脫液低溫(<45°C)真空濃縮，濃縮至無乙醇味，所得濃縮液趁熱過濾(先過濾紙，再過0.45iim膜)，得沉澱A.(5)濾液用18X鹽酸ph值調至(12)，析出沉澱，常溫靜置。待沉澱完全後離心，廢棄離心上清，得沉澱B。(6)用蒸餾水清洗離心沉澱B，直至中性。(7)清洗好的沉澱B和沉澱A放入真空乾燥箱內，4(TC真空乾燥即得到金絲桃素成PRo採用本發明的工藝製備的貫葉連翹提取物，其金絲桃素含量經過HPLC檢測達到30%-100%以上，並且工藝中所使用到的試劑都為國家規定的常規試劑，適合工業化生產。使用本發明製備的貫葉連翹提取物和使用其他方法提取的質量比較如下表tableseeoriginaldocumentpage4(四)圖1:含量90%金絲桃素和30%金絲桃素對甲1亞型流感病毒PR8感染小鼠(古)死亡的治療保護作用圖2:含量90%金絲桃素和30%金絲桃素對甲1亞型流感病毒PR8感染小鼠肺指數的影響圖3:採用了比較直觀的工藝流程簡圖來表示本發明工藝過程。(五)具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例1:90%含量金絲桃素和30%含量金絲桃素對小鼠體內感染流感病毒的保護實驗摘要取1719g的ICR小鼠70隻，雄性，按體重隨機分成7組，即空白對照組、模型對照組、90%金絲桃素低劑量組(1.5mgkg-l)、90%金絲桃素高劑量組(3.Omgkg-l)、30%金絲桃素低劑量組(75mg*kg-l)、30%金絲桃素高劑量組(150mg*kg-l)和陽性對照組(達菲lOmgkg-l)。各組小鼠自感染病毒前1天開始每日給予相應藥物，觀察90%金絲桃素和30%金絲桃素對ICR小鼠體內感染流感病毒的死亡保護作用，並與陽性藥-10mgkg-1達菲進行比較。試驗結果發現，(1)3.0mg'kg-l含量90X金絲桃素具有較高的死亡保護率、延長生命率；(2)在甲1亞型流感病毒PR8感染第4天，各試藥組中，3.Omg*kg_l含量90%金絲桃素組小鼠出現的死亡時間最晚(第4天)，而1.5mg*kg-l含量90%金絲桃素組的死亡率較高(80%);(3)感染第5天，150mg'kg-l含量30%金絲桃素組出現較高死亡率(70%);(4)在感染第8天，各給藥組病毒感染小鼠的存活率明顯高於模型對照組，其中3.Omg*kg-l含量90%金絲桃素組和150mgkg-l含量30%金絲桃素組效果較好；(5)在感染第14天，3.Omgkg-l含量90%金絲桃素組小鼠的存活率最高(60%)。以上試驗結果表明，給予90%金絲桃素和30%金絲桃素，能降低病毒感染小鼠的死亡率，對流感病毒致死小鼠有明顯的保護作用，其作用效果存在一定的劑量關係。其綜合作用效果，90%含量金絲桃素的抗病毒效果明顯優於30%含量金絲桃素，兩者作用強度弱於10mgkg-l達菲。1.試驗目的觀察90%金絲桃素和30%金絲桃素對10小鼠感染流感病毒的死亡保護作用，並與陽性對照品-lOmgkg—1達菲進行比較，為評價90%金絲桃素到30%金絲桃素的臨床前藥效學研究提供初步的依據。2.受試藥物2.l測試樣品2.1130%含量金絲桃素提取(1)稱取lkg含量為0.3%的貫葉連翹提取物，20倍量的3%二乙醇胺水溶液使溶解，溶液通過濾布(100400目)過濾，避光操作。濾液以20-40ml/hr流速通過吸附柱(cht30)，然後依次以20倍量水、0.35%純鹼溶液衝洗吸附柱(cht30)，直至純鹼洗脫下來的溶液在350nm處的吸收度《0.3，純鹼溶液衝洗完畢後，又依次再加20倍量1.0%檸檬酸溶液、20倍量水、20倍量的75%乙醇溶液衝洗柱子，棄去洗脫液。然後以20倍量0.5%二乙醇胺乙醇(80%乙醇)溶液洗脫金絲桃素，收集金絲桃素洗脫液。金絲桃素洗脫液低溫(<45°C)真空濃縮，濃縮至無乙醇味，所得濃縮液趁熱過濾(先過濾紙，再過0.45iim膜)，得沉澱A。(2)濾液用18X鹽酸pH值調至(12)，析出沉澱，常溫靜置。待沉澱完全後離心，廢棄離心上清，得沉澱B。用蒸餾水清洗離心沉澱B，直至中性。(3)清洗好的沉澱B和沉澱A放入真空乾燥箱內，4(TC真空乾燥即得到金絲桃素成A0.52g，B1.Olg。HPLC含量測定30%成品得率1.53g2.1290%含量金絲桃素提取(1)稱取lkg含量為0.3%的貫葉連翹提取物，20倍量的3%二乙醇胺水溶液使溶解，溶液通過濾布(100400目)過濾，避光操作。濾液以20-40ml/hr流速通過吸附柱(cht30)，然後依次以20倍量水、0.35%純鹼溶液衝洗吸附柱(cht30)，直至純鹼洗脫下來的溶液在350nm處的吸收度《0.3，純鹼溶液衝洗完畢後，又依次再加20倍量1.0%檸檬酸溶液、20倍量水、20倍量的75%乙醇溶液衝洗柱子，棄去洗脫液。然後以20倍量O.5%二乙醇胺乙醇(80%乙醇)溶液洗脫金絲桃素，收集金絲桃素洗脫液。金絲桃素洗脫液低溫(<45°C)真空濃縮。(2)濃縮後的液體加水，20倍量的3%二乙醇胺水溶液使溶解，溶液通過濾布(100400目)過濾，避光操作。濾液以20-40ml/hr流速通過吸附柱(cht30)，然後依次以20倍量水、0.35%純鹼溶液衝洗吸附柱(cht30)，直至純鹼洗脫下來的溶液在350nm處的吸收度《0.3，純鹼溶液衝洗完畢後，又依次再加20倍量1.0%檸檬酸溶液、20倍量水、20倍量的75%乙醇溶液衝洗柱子，棄去洗脫液。然後以20倍量0.5%二乙醇胺乙醇(80%乙醇)溶液洗脫金絲桃素，收集金絲桃素洗脫液。金絲桃素洗脫液低溫(<45°C)真空濃縮。濃縮至無乙醇味，所得濃縮液趁熱過濾(先過濾紙，再過0.45iim膜)，得沉澱A.(3)濾液用18X鹽酸pH值調至(12)，析出沉澱，常溫靜置。待沉澱完全後離心，廢棄離心上清，得沉澱B。用蒸餾水清洗離心沉澱B，直至中性。(4)清洗好的沉澱B和沉澱A放入真空乾燥箱內，4(TC真空乾燥即得到金絲桃素成品AO.13gB0.22g。HPLC含量測定90%成品得率0.35g2.1390%含量金絲桃素紫黑色小顆粒，避光常溫乾燥保存，先以一定量無水乙醇溶解，再用蒸餾水配製至所需濃度；30%含量金絲桃素黃白色絮狀物，避光常溫乾燥保存，用蒸餾水溶解至所需濃度。2.2陽性對照品達菲(磷酸奧司他韋膠囊)1粒膠囊含75mg奧司他韋；產品批號B1058，分裝批號SH0009;性狀為灰白色和淺黃色雙色膠囊，內容物為白色至黃白色粉末；由瑞士巴賽爾豪夫邁羅氏有限公司生產，以蒸餾水配製至所需濃度。2.3陰性對照品蒸餾水，浙江中醫藥大學自製。3.試驗動物ICR小鼠，清潔級，體重1719g，70隻，雄性，由中國科學院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司提供，生產許可證SCXK(滬)2003-0003。4.實驗條件屏障系統小鼠實驗飼養室，溫度22士rC，溼度50-70%，光照150-200Lx，12小時明暗交替，噪音<50dB，使用許可證SYXK(浙)2003-0003。自來水過濾滅菌，置於高壓滅菌的飲水瓶中自由飲用，用滅菌小鼠全價營養顆粒飼料飼喂。飼養方式自由飲食，小鼠飼養籠中給予充足的飼料和水，每籠飼養5隻小鼠，試驗前，每隻小鼠稱重、標記編號。5.劑量設置90%含量金絲桃素高劑量組3.Omgkg—1(相當於人臨床擬用劑量30倍)90%含量金絲桃素低劑量組1.5mgkg—1(相當於人臨床擬用劑量15倍)30%含量金絲桃素高劑量組150mgkg—1(相當於人臨床擬用劑量30倍)630%含量金絲桃素低劑量組75mgkg—1(相當於人臨床擬用劑量15倍)陽性對照組達菲10mgkg—1(相當於人用劑量4倍)模型對照組蒸餾水10mlkg—1空白對照組蒸餾水10mlkg—16.給藥途徑和容量給藥途徑經口灌胃給藥給藥容量10mlkg—1體重7.儀器與試劑7.1甲1亞型流感病毒PR8鼠肺適應株，由浙江省疾病預防控制中心提供；7.2乙醚無色易揮發液體，規格500ml/瓶，上海馬陸製藥廠，批號20040319;7.3微量進樣器(25ul):上海醫用雷射儀器廠；7.4無水乙醇無色易揮發液體，規格500ml/瓶，杭州化學試劑有限公司，批號200510;8.試驗方法取1719g的ICR小鼠70隻，雄性，按體重隨機分為7組，每組10隻，即空白對照組、模型對照組、90%金絲桃素低劑量組、90%金絲桃素高劑量組、30%金絲桃素低劑量組、30%金絲桃素高劑量組和陽性對照組(達菲)。各組小鼠自感染病毒前1天開始分別給予相應藥物10mlkg—、空白對照組、模型對照組給予相應容積的蒸餾水10mlkg—、感染病毒當日，給藥1小時後，各組小鼠在乙醚的淺麻醉下，分別以流感病毒5LD5。滴鼻感染，每鼠20，空白對照組滴鼻給予生理鹽水。自感染後連續給藥兩周，，觀察ICR小鼠感染流感病毒後發病及死亡情況，死亡小鼠解剖後肉眼觀察，以肺病變"+++"以上的程度為判斷標準，記錄14天內死亡數，計算死亡率％、死亡保護率％、延長生命率％。死亡只數死亡率％=_xioo%動物數對照組死亡率一給藥組死亡率死亡保護率％=_xioo%對照組死亡率給藥組平均存活日數-對照組平均存活曰數延長生命率％=_xi00%對照組平均存活日數9.數據處理用NDST8.8W軟體進行統計分析，計量資料應用X2檢驗評價試驗結果。10.試驗結果10.190%含量金絲桃素和30%金絲桃素對甲1亞型流感病毒PR8感染小鼠(古)的影響由表1可見，75mgkg—1含量30金絲桃素組小鼠死亡率和死亡保護率與模型對照組相同。其餘各給藥組與模型對照組比較，給予試驗藥物後，病毒感染小鼠的死亡率降低，死亡保護率、延長生命率均有提高，說明試藥對雄性ICR小鼠有一定的保護作用。其中3.0mgkg—1含量90%金絲桃素具有較高的死亡保護率、延長生命率(P<0.05)，但其作用效果弱於10mgkg—1達菲(P<0.01);1.5mgkg—1含量90%絲桃素組和150mgkg—1含量30%金絲桃素組具有相似的作用效果，都弱於10mgkg—1達菲。由表2和圖1顯示，3.0mgkg—'含量90X金絲桃素組出現死亡時間最晚(感染第4天)；在流感病毒感染第4天，1.5mgkg—1含量90%金絲桃素組死亡率較高；感染第5天，150mgkg—1含量30%金絲桃素組出現較高死亡率；感染第8天，各給藥組病毒感染小鼠的存活率明顯增高，其中3.Omg'kg—1含量90%金絲桃素組和150mg*kg—1含量90%金絲桃素組效果較好；在感染後14天3.Omgkg—1含量90%金絲桃素組內小鼠的存活率最高，75mgkg—1含量30%金絲桃素組存活率與模型組相當。表l含量90%金絲桃素和30%金絲桃素對甲1亞型流感病毒PR8感染小鼠($)的影響tableseeoriginaldocumentpage8注與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。表2含量90%金絲桃素和30%金絲桃素對甲1亞型流感病毒PR8感染小鼠(古)存活率的影響tableseeoriginaldocumentpage9各劑量組的存活率曲線對比請看說明書附圖中圖1所示。11.討論流行性感冒病毒是由流感病毒引起的一種常見急性呼吸道傳染病，目前對流感病毒治療的有效藥物不多，國內外用於抗甲型流感病毒的藥物有金剛烷胺和甲基金剛烷胺、幹擾素等，但這些藥物在使用中常常受到許多條件的限制，同時由於流感病毒的變異性以及藥物的耐藥等因素，使當前流感的防治形勢，依然相當嚴峻。本試驗選用的小鼠流感病毒性肺炎是用流感病毒小鼠適應株所致的出血性肺炎的模型，是最常用的病毒致整體動物感染模型。小鼠感染病毒後引起肺炎，導致肺組織內炎症細胞滲出增多，形成肝樣實變。本試驗結果發現，小鼠感染流感病毒後第2天起開始出現明顯症狀，表現為採食量下降，消瘦，活動減少，聳毛，毛松，倦縮，並出現不同程度的呼吸困難。感染髮病後45天開始發生死亡，一直持續到感染後1214天。本試驗結果顯示，與模型對照組比較，經口灌胃給予不同濃度的金絲桃素後，均能不同程度地降低病毒感染小鼠的死亡率，提高流感病毒感染小鼠的死亡保護率和延長生命率。試驗結果表明高含量的金絲桃素對流感病毒具有一定的抑制作用，在90%金絲桃素和30%金絲桃素各劑量組中，3.0mgkg—'含量90X金絲桃素組出現死亡時間最晚，死亡率最低、死亡保護率和延長生命率均較高，具有較好的抗流感病毒作用；其中1.5mg*kg—1含量90%金絲桃素組和150mgkg—1含量30%金絲桃素組作用效果相當。在甲型流感病毒PR8感染中期(感染8天)，各給藥組病毒感染小鼠的存活率明顯增高，其中，3.Omgkg—1含量90%金絲桃素組存活率最高，其次是1.5mgkg—1含量90%金絲桃素組和150mgkg—1含量30%金絲桃素組。綜上所述，給予含量90%金絲桃素和含量30%金絲桃素，能降低病毒感染小鼠的死亡率，對病毒致死小鼠有明顯的保護作用，其效果，含量90%金絲桃素作用較佳，含量30%金絲桃素次之，但均弱於10mgkg—1達菲。12.結論以上試驗結果表明，給予含量90%金絲桃素和含量30%金絲桃素，能降低病毒感染小鼠的死亡率，對病毒致死小鼠有明顯的保護作用，其綜合效果，高含量90%金絲桃素的作用較佳，含量30%金絲桃素次之，但均弱於10mgkg—1達菲。實施例2:金絲桃素和異金絲桃素對流感病毒感染小鼠肺指數的影響摘要取1719g的ICR小鼠70隻，雄性，按體重隨機分組，即為空白對照組、模型對照組、90%金絲桃素低劑量組、90%金絲桃素高劑量組、30%金絲桃素低劑量組、30%金絲桃素高劑量組和陽性對照組(達菲)。各組小鼠自感染病毒前1天開始每日給予相應藥物，觀察含量90%金絲桃素30X金絲桃素對ICR小鼠流感病毒感染肺指數的影B向，並與陽性藥-lOmgkg—1達菲進行比較。試驗結果發現，(1)給予不同濃度的含量90%金絲桃素後能降低流感病毒感染小鼠的肺指數值，升高肺指數抑制率，3.Omg*kg—工含量90X金絲桃素的作用效果相當於10mgkg—1達菲。(2)給予不同濃度的含量30%金絲桃素後亦能降低流感病毒感染小鼠的肺指數值，升高肺指數抑制率，但其作用效果弱於10mg*kg—1達菲。(3)含量30%金絲桃素有一定的抑制小鼠流感病毒的作用，但對病情嚴重的小鼠保護作用弱。以上試驗結果表明，3.Omgkg—1含量90%金絲桃素和150mgkg—1含量30%金絲桃素對小鼠的死亡保護作用較佳。1.試驗目的觀察含量90%金絲桃素和30%金絲桃素對ICR小鼠流感病毒感染肺指數的影響，10並與陽性對照品-10mgkg—1達菲進行比較，為評價含量90%金絲桃素到30%金絲桃素的研究開發提供初步的依據。2.受試藥物2.l測試樣品2.1130%含量金絲桃素提取(1)稱取lkg含量為0.3X的貫葉連翹提取物，20倍量的3X二乙醇胺水溶液使溶解，溶液通過濾布(100400目)過濾，避光操作。濾液以20-40ml/hr流速通過吸附柱(cht30)，然後依次以20倍量水、0.35%純鹼溶液衝洗吸附柱(cht30)，直至純鹼洗脫下來的溶液在350nm處的吸收度《0.3，純鹼溶液衝洗完畢後，又依次再加20倍量1.0%檸檬酸溶液、20倍量水、20倍量的75%乙醇溶液衝洗柱子，棄去洗脫液。然後以20倍量0.5%二乙醇胺乙醇(80%乙醇)溶液洗脫金絲桃素，收集金絲桃素洗脫液。金絲桃素洗脫液低溫(<45°C)真空濃縮，濃縮至無乙醇味，所得濃縮液趁熱過濾(先過濾紙，再過0.45iim膜)，得沉澱A。(2)濾液用18X鹽酸pH值調至(12)，析出沉澱，常溫靜置。待沉澱完全後離心，廢棄離心上清，得沉澱B。用蒸餾水清洗離心沉澱B，直至中性。(3)清洗好的沉澱B和沉澱A放入真空乾燥箱內，4(TC真空乾燥即得到金絲桃素成A0.52g，B1.03g。HPLC含量測定30%成品得率1.55g2.1290%含量金絲桃素提取(1)稱取lkg含量為O.3%的貫葉連翹提取物，20倍量的3%二乙醇胺水溶液使溶解，溶液通過濾布(100400目)過濾，避光操作。濾液以20-40ml/hr流速通過吸附柱(cht30)，然後依次以20倍量水、0.35%純鹼溶液衝洗吸附柱(cht30)，直至純鹼洗脫下來的溶液在350nm處的吸收度《0.3，純鹼溶液衝洗完畢後，又依次再加20倍量1.0%檸檬酸溶液、20倍量水、20倍量的75%乙醇溶液衝洗柱子，棄去洗脫液。然後以20倍量0.5%二乙醇胺乙醇(80%乙醇)溶液洗脫金絲桃素，收集金絲桃素洗脫液。金絲桃素洗脫液低溫(<45°C)真空濃縮。(2)濃縮後的液體加水，20倍量的3%二乙醇胺水溶液使溶解，溶液通過濾布(100400目)過濾，避光操作。濾液以20-40ml/hr流速通過吸附柱(cht30)，然後依次以20倍量水、0.35%純鹼溶液衝洗吸附柱(cht30)，直至純鹼洗脫下來的溶液在350nm處的吸收度《0.3，純鹼溶液衝洗完畢後，又依次再加20倍量1.0%檸檬酸溶液、20倍量水、20倍量的75%乙醇溶液衝洗柱子，棄去洗脫液。然後以20倍量0.5%二乙醇胺乙醇(80%乙醇)溶液洗脫金絲桃素，收集金絲桃素洗脫液。金絲桃素洗脫液低溫(<45°C)真空濃縮。濃縮至無乙醇味，所得濃縮液趁熱過濾(先過濾紙，再過0.45iim膜)，得沉澱A.(3)濾液用18X鹽酸pH值調至(12)，析出沉澱，常溫靜置。待沉澱完全後離心，廢棄離心上清，得沉澱B。用蒸餾水清洗離心沉澱B，直至中性。(4)清洗好的沉澱B和沉澱A放入真空乾燥箱內，4(TC真空乾燥即得到金絲桃素成PR:A0.llgB0.23g。HPLC含量測定90%成品得率0.34g2.13含量90%金絲桃素紫黑色小顆粒，避光常溫乾燥保存，先以一定無水乙醇溶解，再用蒸餾水配製至所需濃度；含量30%金絲桃素黃白色絮狀物，避光常溫乾燥保存，用蒸餾水溶解至所需濃2.2陽性對照品達菲(磷酸奧司他韋膠囊)l粒膠囊含75mg奧司他韋；產品批號B1058，分裝批號SH0009;性狀為灰白色和淺黃色雙色膠囊，內容物為白色至黃白色粉末；由瑞士巴賽爾豪夫邁羅氏有限公司生產，以蒸餾水配製至所需濃度。2.3陰性對照品蒸餾水，浙江中醫藥大學自製。3.試驗動物ICR小鼠，清潔級，體重1719g，70隻，雄性。由中國科學院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司提供，生產許可證SCXK(滬)2003-0003。4.實驗條件屏障系統小鼠實驗飼養室，溫度22士rC，溼度50-70%，光照150-200Lx，12小時明暗交替，噪音<50dB，使用許可證SYXK(浙)2003-0003。自來水過濾滅菌，置於高壓滅菌的飲水瓶中自由飲用，用滅菌小鼠全價營養顆粒飼料飼喂。飼養方式自由飲食，小鼠飼養籠中給予充足的飼料和水，每籠飼養5隻小鼠，試驗前，每隻小鼠稱重、標記編號。2005105.劑i含量90%金絲桃素高劑量含量90%金絲桃素低劑量含量30%金絲桃素高劑量含量30%金絲桃素低劑量陽性對照組達菲10mg模型對照組蒸餾水10ml激:3.Omgkg-1(相當於人臨床擬用劑j激:1.5mgkg-1(相當於人臨床擬用劑jl;組150mgkg—1(相當於人臨床擬用劑jl;組75mgkg—1(相當於人臨床擬用劑量kg—、相當於人用劑量4倍)kg—1kg—1I:30倍)I:i5倍)1:30倍)15倍)空白對照組蒸餾水10ml6.給藥途徑和容量給藥途徑經口灌胃給藥給藥容量10ml*kg—H本重7.儀器與試劑7.1甲1亞型流感病毒PR8鼠肺適應株由浙江省疾病預防控制中心提供7.2乙醚無色易揮發液體，規格500ml/瓶，上海馬陸製藥廠，批號200403197.3微量進樣器(25ul):上海醫用雷射儀器廠7.4無水乙醇無色易揮發液體，規格500ml/瓶，杭州化學試劑有限公司，批號7.5分析天平JA2103N精密天平，上海民橋精密科學儀器有限公司8.試驗方法取1719g的ICR小鼠70隻，雄性，按體重隨機分為7組，每組10隻，即空白對照組、模型對照組、90%金絲桃素低劑量組、90%金絲桃素高劑量組、30%金絲桃素低劑量組、30%金絲桃素高劑量組和陽性對照組(達菲)。各組小鼠自感染病毒前l天開始分別給予相應藥物。感染病毒當日，給藥後1小時，各組小鼠在乙醚的淺麻醉下，分別以流感病毒5LD5。滴鼻感染，每鼠20ul，空白對照組滴鼻給予生理鹽水。感染後第4天稱重並處死，摘取肺臟稱重，逐個計算肺指數值和肺指數抑制率。formulaseeoriginaldocumentpage13病毒對照組平均肺脂數-實驗組平均肺指數肺指數抑制率=-xioo%病毒對照組平均肺指數9.數據處理用NDST8.8W軟體進行統計分析，計量資料應用X2檢驗評價試驗結果。10.試驗結果由表l和圖l可見，與空白對照組比較，模型對照組小鼠肺指數值差異顯著(P<0.01)。與模型對照組比較，各試藥組的肺指數值均小於模型對照組，肺指數抑制率均大於模型對照組。其中3.0mgkg—1含量90X金絲桃素組、150mgkg—1含量30%金絲桃素組小鼠的肺指數值均小於模型對照組(P<0.05);各試驗藥物組比較，3.Omg*kg—1含量90%金絲桃素組效果最佳，其作用效果相當於lOmgkg—1達菲；150mgkg—1含量30%金絲桃素組對小鼠有一定的保護作用，但對病情嚴重的小鼠保護作用弱，感染後第4天已有小鼠死亡，且作用效果弱於10mgkg—1達菲。表1含量90%金絲桃素和30%金絲桃素對甲1亞型流感病毒PR8感染小鼠肺指數的影響tableseeoriginaldocumentpage14注與模型對照組比較JP<0.05，**P<0.Ol，與空白對照組比較，AP<0.05，△△P<0.01。各劑量對照組肺指數的矩形圖請看說明書附圖中的圖2所示。11.討論小鼠流感病毒性肺炎是用流感病毒小鼠適應株所致的出血性肺炎的模型，是最常用的病毒致整體動物感染模型。小鼠感染病毒後引起肺炎，導致肺組織內炎症細胞滲出增多，形成肝樣實變，使全部肺質量增加，肺質量增加和肺炎的嚴重程度相關。本實驗採用流感病毒體內實驗方法，模型對照組小鼠感染流感病毒後第2天起開始出現明顯症狀，表現為採食量下降，消瘦，活動減少，聳毛，毛松，倦縮，並出現不同程度的呼吸困難。感染髮病後45天開始發生死亡，一直持續到感染後1214天。與模型對照組相比，實驗小鼠給予不同濃度的金絲桃素後能降低感染流感病毒小鼠的肺指數值，升高肺指數抑制率，說明含量90%金絲桃素和30%金絲桃素有較好地抑制小鼠流感病毒的作用，能抑制病毒所致肺炎發生、發展，使其炎症減輕。兩種含量中，90%金絲桃素對小鼠的死亡保護作用較佳；30%金絲桃素有一定的抑制小鼠流感病毒的作用，但對病情嚴重的小鼠保護作用弱，實驗第四天高低劑量30%金絲桃素組均出現小鼠死亡情況。12.結論以上試驗結果表明，含量90%金絲桃素和30%金絲桃素均有較好的體內抗病毒作用，其中，含量90X金絲桃素對小鼠的死亡保護作用較佳，其效果相當於10mg'kg—工達菲；含量30%金絲桃素對病情嚴重的小鼠保護作用較弱，對中等病情的小鼠能較好地抑制其病毒所致肺炎發生，作用效果略弱於10mgkg—1達菲。權利要求含量為30％-100％天然金絲桃素有抗病毒的效果。從天然植物貫葉連翹中用自創的分子捕獲技術提取的含量為30％-100％的金絲桃素，這樣的金絲桃素對廣譜的病毒有殺滅作用，並且去除了金絲桃素光敏副作用。2.根據權利要求1所述其特徵是從天然植物貫葉連翹中提取的含量30%-100%的金絲桃素。3.根據權利要求1所述其特徵是30%_100%的金絲桃素對廣譜的病毒有殺滅作用。4.根據權利要求1所述其特徵是30%_100%的金絲桃素已經去除了光敏副作用。5.根據權利要求1所述其特徵是所指病毒是感冒病毒、愛滋病毒、肝炎病毒、非典病毒、禽流感病毒、人類乳頭瘤病毒、皰疹病毒。6.根據權利要求1所述其分子結構是formulaseeoriginaldocumentpage27.根據權利要求1所述其異構體分子結構是formulaseeoriginaldocumentpage2全文摘要本發明是一種以目前市場所售的普通貫葉連翹提取物為原料，用自創的分子捕獲技術提取得到高含量的金絲桃素hypericin，並且活性可測成份30％-100％。這個天然的含量為30％-100％金絲桃素新藥有抗病毒效果，這樣的金絲桃素對廣譜的病毒有殺滅作用，並且去除了金絲桃素光敏副作用。其金絲桃素(hypericin)含量經過HPLC檢測達到30％-100％。並且本發明的製備方法操作簡便快捷，產品質量均一穩定，大生產容易實現，符合工業化生產。分子結構文檔編號A61K31/122GK101744794SQ20081020417公開日2010年6月23日申請日期2008年12月8日優先權日2008年12月8日發明者馬世界,黃亮,黃肖輝申請人:上海四埃美微科技有限公司