多環芳烴降解菌及其應用的製作方法
2023-06-08 04:04:36
專利名稱：多環芳烴降解菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於有機汙染物生物修復技術領域，具體的說一種多環芳烴降解菌及其應用。
背景技術：
多環芳烴(PAHs)是一類廣泛分布於環境中的有機汙染物，是石油、煤炭等化石燃料燃燒過程及能源轉化過程的副產物，對人體具有潛在的三致危害性。由於PAHs的潛在致癌性、致畸性、致突變性，已引起各國的高度重視。目前對於PAHs汙染土壤生物修復技術已有很多研究，其優點是①費用省，其費用約為焚燒處理費用的1/4-1/3。②環境影響小，生物修復只是一個自然過程的強化，其最終 產物是二氧化碳、水和脂肪酸等，不形成二次汙染或導致汙染物轉移。③可以最大限度地降低汙染物濃度等。且能改良土壤，提高地力，因此具有廣泛的應用和發展前景。瀋陽撫順灌區已有多年的汙灌歷史，土壤中積累了大量的PAHs，由於低環組分易於揮發、降解，而中高環部分的自然降解能力相對較低，因此土壤中更多地積累了 PAHs高環組分，其中PAHs含量按環數排列4環> 5環> 3環> 6環> 2環，屬於老化的石油源汙染土壤。針對這種情況本研究以3環的菲、4環的芘、5環的苯並(a)芘)為主，以優勢降解菌活性與修復效率為目標，研究了多種菌株的活性和降解能力，其中毛黴(Mucor sp.)的菌株FMM的降解效果最好。實驗結果為大規模的原位修復PAHs汙染土壤工程提供科學依據。
發明內容
本發明的目的是提供一種多環芳烴降解菌及其應用。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種多環芳烴降解菌所述降解菌為毛黴(Mucor sp.)的菌株FMM，其以於2011年3月23日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC M 2011092。多環芳烴降解菌的應用所述菌株毛黴(Mucor sp. )FMM作為多環芳烴的降解菌齊U。該菌劑作為菲(3環)、芘(4環)和/或苯並(a)芘(5環)的降解菌劑。將所述菌劑按5-10 (質量)％的接種量投加到汙染土壤或水體中。本發明所具有的優點本發明所得菌株篩選自老汙灌區PAHs汙染土壤，經過含PAHs汙染物的富集培養基的富集培養，再以PAHs汙染物為唯一碳源的無機鹽培養基馴化培養、篩選、分離、純化獲得。能以菲、芘和苯並(a)芘為唯一碳源和能源生長，在無機鹽培養基中，當菲、芘和苯並(a)芘的濃度為72. 84mg/l、67. 49mg/l和40. 34mg/l時，9天內菲、芘和苯並(a)芘的降解率分別為95. 33%,95. 16%和90. 36%。本發明所述FMM菌株降解性能穩定，降解底物範圍較廣，適用於酸性PAHs汙染土壤及水的生物修復(pH5-6. 5)。
圖I為本發明提供的毛黴(Mucorsp.)的菌株FMM菌落形態圖。圖2為本發明提供的毛黴(Mucorsp.)的菌株FMM孢囊梗及孢子囊圖。圖3為本發明提供的毛黴(Mucorsp.)的菌株FMM對3種汙染物的降解率圖。圖4為本發明提供的毛黴(Mucorsp.)的菌株FMM對3種汙染物的去除效果圖。
具體實施例方式實施例I毛黴(Mucor sp.)菌株FMM的篩選和菌落形態。高效降解菌毛黴(Mucor sp.)菌株FMM的篩選菌液的製備在90ml含有PAHs汙染物的富集培養基中，加入IOg汙灌區(撫順市三寶屯北後屯耕層土壤)老化的PAHs汙染土壤,於120rpm/min恆溫(25°C )搖床中振 蕩培養7d，待用。所述含有PAHs汙染物的富集培養基為將2. 5ml PAHs溶液加入到無菌的500ml三角瓶中，使富集培養基中多環芳烴總量濃度為200mg/L ;待溶劑揮發完後，再將分裝好的90ml無菌富集培養基倒入三角瓶中。所述富集培養基按重量百分比計為葡萄糖0. 1%,蛋白腖 0. 05%，酵母膏 0. 05%，NaCl 0. 5%, NH4NO3 I. 0%, K2HPO4 0. 5%, KH2PO4 0. 5%,MgSO4. 7H20 0. 02%，餘量為自來水，pH 6. O。滅菌條件為:0. IMpa溼熱滅菌30min。而後按10% (質量)接種量將上述種液轉接到裝有30ml無機鹽培養基的150ml三角瓶中，使培養基中PAHs總量濃度約為200mg/L。於25°C，120rpm/min條件下進行馴化培養7d。以此重複三次上述富集培養和馴化培養即為降解PAHs的菌液。所述無機鹽培養基按照重量百分比計(% ) =NaCl 0. 01 ；NH4NO3 0. I ；CaCl2 0. 01 ；MgSO4. 7H20 0. 02 ；FeCl3 0. 002 ；KH2PO4 0. I ；K2HPO4 0. 1，水 100ml, pH 為 6. O。在上述菌液中通過平板分離、純化獲得毛黴(Mucor sp.)的菌株FMM。(參見圖I、圖2)。上述菌株已於2011年3月23日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC M 2011092。毛黴(Mucor sp.)的菌株FMM菌體形態為無假根和匍匐枝，孢囊梗直接由菌絲體生出，單生，不分枝頂端有膨大的孢子囊，孢子囊球形，囊軸與孢囊梗相連處無囊託。菌落形態見圖I。孢囊梗及孢子囊形態見圖2。菌株FMM最適生長及最佳降解溫度為23°C _28°C，在低於10°C或高於40°C時生長緩慢，最適生長PH值為5-6。實施例2將上述分離、純化後的毛黴(Mucor sp.)的菌株FMM進行活化，所述活化即把一支固體斜面保存的FMM菌株的試管，全部轉移到150ml三角瓶中，每瓶裝有30ml已滅菌的PDA培養基。130轉/min，25°C振蕩培養7d。即為FMM菌液。所述PDA培養基馬鈴薯200g、蔗糖 20g，水 1000ml, pH6. O。降解效果實驗採用搖瓶液體培養法進行。每個處理設3個重複。在無菌條件下，吸取0. 60mlPAHs溶液置於已滅菌的150ml空三角瓶中，蓋上通氣的高溫塑料膜，通風至近幹，再加入0. 5ml丙酮，通過振搖將汙染物溶解，再通風至近幹，加入30ml已滅菌的無機鹽培養基，接種已活化的1.5ml(接種量5% )FMM菌液，振蕩培養，130轉/min，25°C震蕩培養9天。將上述培養9天後的培養液進行處理，採用二氯甲烷萃取，在三角瓶中加入二氯甲烷10ml，蓋上密封塑料膜，180轉/min振蕩5min，靜止分層後，下層(二氯甲烷層)放入裝有無水Na2SO4漏鬥中，過濾到25ml比色管中。上層再萃取兩次，步驟同上，最後定容至25.01111，取21111過0.2211111有機膜。準確吸取過膜後的液體40ul置於樣品瓶中，自然揮發近幹後，用過膜的色譜純甲醇定容至1ml， 用高效液相色譜儀測定。分析培養液中汙染物的殘留濃度，根據初始投加量的減少，計算去除率(參見表I及圖3)。由表I和圖3可知9天後的殘留濃度測定結果，及菌株毛黴-FMM對3種汙染物的降解率。結果表明，當菲、芘和苯並[a]芘初始濃度為72. 84mg/l、67. 49mg/l和40. 34mg/l時，9天內菲、芘和苯並(a)芘的降解率分別為96. 86%、95. 38%和90. 70%.相同條件下不接種FMM菌液的對照菲、芘和苯並(a)芘的降解率僅為14.02%、
3.08%和 4. 64%。所述PAHs溶液為菲、芘和苯並(a)芘混合液，菲、芘濃度為4mg/ml，苯並[a]芘為2mg/ml，3種汙染物濃度總量約為10mg/ml，溶劑為二氯甲烷。所述無機鹽培養基按照重量百分比計(％ ) :NaCl 0. Ol ；NH4N03 0. I ；CaC12
0.Ol ；MgS04. 7H20 0. 02 ；FeCl3 0. 002 ；KH2PO4 0. I ；K2HPO4 0. 1，水 100ml, pH 為 6. 0。表I菌株毛黴-FMM降解PAHs 9d後的殘留濃度(mg L—1)
PAHs 總
處理菲芘苯並U]芘量初始濃度 72. 84 67. 49 40. 34 180. 67
62. 63 65. 41 38. 47 166. 50 F匪2.2^~ 3.12 — 3. 759.17實施例3將上述FMM菌液，從冰箱中取出放置至室溫，進行活化。所述活化即在無菌條件下，按10% (質量)接種至已滅菌的PDA培養基中。用150ml三角瓶，每瓶裝有30ml已滅菌的PDA培養基。130轉/min，25°C振蕩培養7d。即為FMM菌液。實驗採用搖瓶液體培養法進行。每個處理設3個重複。在無菌條件下，吸取
0.60mlPAHs溶液置於已滅菌的150ml空三角瓶中，蓋上通氣的高溫塑料膜，通風至近幹，再加入0. 5ml丙酮，通過振搖將汙染物溶解，再通風至近幹，加入已滅菌的30ml無機鹽培養基中。30ml培養基接種3ml菌劑(接種量10 % )，振蕩培養，130轉/min，28°C震蕩培養10天。將上述培養9天後的培養液進行處理，採用二氯甲烷萃取，在三角瓶中加入二氯甲烷10ml，蓋上密封塑料膜，180轉/min振蕩5min，靜止分層後，下層(二氯甲烷層)放入裝有無水Na2SO4漏鬥中，過濾到25ml比色管中。上層再萃取兩次，步驟同上，最後定容至25. 0ml，取2ml左右過0. 22um有機膜。準確吸取過膜後的液體40ul置於樣品瓶中，自然揮發近幹後，用過膜的色譜純甲醇定容至Iml，用高效液相色譜儀測定。分析培養液中汙染物的殘留濃度，根據初始投加量的減少，計算去除率(參見表2及圖4)。結果表明，當菲、芘和苯並[a]芘初始濃度為93.94mg/ml、95. 26mg/ml和44. 44mg/ml時，10天後去除率為90. 80%、89. 83 %和85. 70 %。不投加菌劑的對照去除率分別31. 15%、26.97%和17.03%。實驗結果表明FMM菌劑有非常明顯的去除效果。所述PAHs溶液為菲、芘和苯並(a)芘混合液，菲、芘濃度為4mg/ml，苯並[a]芘為2mg/ml，3種汙染物濃度總量約為10mg/ml，溶劑為二氯甲烷。表2菌株毛黴-FMM降解PAHs 10天後的殘留濃度(mg L—1)
權利要求
1.一種多環芳烴降解菌，其特徵在於所述降解菌為毛黴(Mucorsp.)的菌株FMM，其以於2011年3月23日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC M2011092。
2.一種按權利要求I所述的多環芳烴降解菌的應用，其特徵在於所述菌株毛黴(Mucor sp. )FMM作為多環芳烴的降解菌劑。
3.按權利要求2所述的多環芳烴降解菌的應用，其特徵在於該菌劑作為菲(3環)、芘(4環)和/或苯並(a)芘(5環)的降解菌劑。
4.按權利要求2或3所述多環芳烴降解菌的應用，其特徵在於將所述菌劑按5-10(質量的接種量投加到汙染土壤或水體中。
全文摘要
本發明屬於有機汙染物生物修復技術領域，具體的說一種多環芳烴降解菌及其應用。所述降解菌為毛黴(Mucor sp.)的菌株FMM，其已於2011年3月23日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC M 2011092。所述菌株毛黴(Mucor sp.)FMM作為多環芳烴的降解菌劑。本發明所述FMM菌株降解性能穩定，降解底物範圍較廣，適用於酸性PAHs汙染土壤及水的生物修復(pH5-6.5)。
文檔編號C12R1/785GK102732429SQ20111009641
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月15日 優先權日2011年4月15日
發明者劉宛, 臺培東, 鞏宗強, 張春桂, 張海榮, 李曉軍 申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所