氮末端腦鈉肽前體/c-反應蛋白/肌鈣蛋白i診斷試紙的製作方法

2023-05-29 01:25:31 3

專利名稱：氮末端腦鈉肽前體/c-反應蛋白/肌鈣蛋白i診斷試紙的製作方法
技術領域：
氮末端腦鈉肽前體/C-反應蛋白/肌鈣蛋白I診斷試紙技術領域本發明涉及一種氮末端腦鈉肽前體、C-反應蛋白、肌鈣蛋白I診斷試紙，屬於免疫層析快速檢測領域。
技術背景氮末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)是體內腦鈉肽前體(proBNP)裂解成腦鈉肽(BNP)時的產 物，主要來源於心肌細胞，在心室的張力及負荷增加時NT-proBNP和BNP升高。氮末端腦 鈉肽前體的水平可準確反映左心衰的嚴重程度，其特異性和敏感性均明顯優於腫瘤壞死因子、 幹擾素、血管緊張肽原酶等指標。對初診醫生排除心力衰竭或作進一步臨床評估，並評估嚴 重程度和預後有很大的幫助。C-反應蛋白(CRP)在急性炎症病人血清中出現，由肝細胞合成，是常用的一種炎症指 標，為全身性炎症反應的非特異性指標。CRP在感染時明顯升高，在急性炎症反應過程中， CRP是機體最敏感的蛋白質之一，並且是機體炎症反應精確的客觀指標。CRP是冠心病的獨 立危險因子之一，在冠心病的預後中具有重要價值；在急性心肌缺血和心肌梗死中，CRP是 升高的。CRP也可作為心肌缺血、心絞痛患的預測因子。CRP也是急性冠脈症候群(ACS) 預後的獨立風險因子。肌鈣蛋白由肌鈣蛋白I、 T、 C三亞基構成，它們和原肌球蛋白一起通過調節(^2+對橫紋 肌動蛋白ATP酶的活性來調節肌動蛋白和肌球蛋白相互作用。當心肌損傷後，心肌肌轉蛋白 複合物釋放到血液中，4-6小時後，開始在血液中升高，升高的肌鈣蛋白I能在血液中保持 很長時間(6-10天)，這樣就提供了較長的檢測期。並且心肌肌鈣蛋白I具有高度的心肌特異 性和靈敏度，所以心肌肌鈣蛋白I已成為目前最理想的心肌梗死標誌物。NT-proBNP對急性冠脈症候群(ACS)進行病情的和療效評估、預後判斷和危險分型時， 可提供有臨床價值的信息；CRP在動脈粥樣硬化、發展及其併發症診斷中有一定作用，但它 並非是特異的；cTnl是目前診斷心肌損傷靈敏性和特異性較好的標誌物，在ACS的危險性分 類中有重要的臨床應用價值。三者作為ACS預後的獨立風險因子同時應用能提高對發生ACS 心血管事件的預測。對以上指標常用的測定方法有放射性免疫法(RIAs)、髙壓液相色譜分析法、生化分析儀、 蛋白分析儀及各種診斷試劑盒。這些方法需要特殊防護設備、嚴苛的條件、價格昂貴的儀器 和訓練有素的人員，而且操作費時、樣本存儲困難，不易於推廣應用。發明內容本發明克服了現有技術中存在的一些問題，提供了一種利用快速免疫層析法，定性地檢 測臨床標本(全血/血清/血漿)中氮末端腦鈉肽前體、C-反應蛋白、肌鈣蛋白I的診斷試紙， 是對急性冠脈症候群預測的一種輔助手段，僅用於體外診斷。為解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的氮末端腦鈉肽前體/C-反應蛋白/肌鈣蛋白I診斷試紙是由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、 顏色顆粒固定墊、樣品吸液層、MAX線組成，底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有 一條氮末端腦鈉肽前體單抗試驗線、 一條C-反應蛋白單抗試驗線、肌鈣蛋白I單抗試驗線和 一條羊抗鼠多克隆抗體控制線，在底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸 纖維素膜兩端分別與吸水板與顏色顆粒固定墊相互交疊連接，在顏色顆粒固定墊上壓有樣品 吸液層。其中顏色顆粒可以是一種金屬膠體顆粒，可包括膠體金顆粒、銀顆粒、鐵顆粒、磁性顆 粒等， 一種標記顆粒，可包括染料顆粒、乳膠顆粒、螢光顆粒等，當採用磁性顆粒時可實現 半定量或全定量檢測。樣品吸液層可以由三層材料疊加組成，第一層為一定規格無紡布層、第二層為玻璃纖維 層、第三層為一定規格無紡布層，上述物質均需經過表面活性劑緩衝液浸泡處理，乾燥後備 用。檢測時，把試紙的取樣端放入檢測樣本中(液面不得超過MAX線)由於毛細管作用檢測 樣品將沿著試紙條向吸水層端移動，樣品中氮末端腦鈉肽前體、c-反應蛋白、肌鈣蛋白I抗 原可與各自相應標記探針發生特異結合後繼續移動與包被在硝酸纖維素膜上的抗體結合，從 而被抗氮末端腦鈉肽前體、抗C-反應蛋白、抗肌鈣蛋白I單克隆抗體識別，即發生雙抗夾心 的特異結合。檢測過程中，當上行液面即滯留於此區域的標記探針將顯示相應的紅色，出現 兩條或以上紅線為陽性，僅出現一條紅線表示為陰性結果。於採用上述技術方案，本發明所提供的氮末端腦鈉肽前體/C-反應蛋白/肌鈣蛋白I診斷 試紙具有這樣的有益效果即特異性強，靈敏度高，易儲存，無須專門技術人員操作，不需 要儀器設備，而且結果易讀。


圖1為氮末端腦鈉肽前體/C-反應蛋白/肌鈣蛋白I診斷試紙的主視結構圖。 圖2為氮末端腦鈉肽前體/C-反應蛋白/肌鈣蛋白I診斷試紙的俯視結構圖。 圖3為氮末端腦鈉肽前體/C-反應蛋白/肌鈣蛋白I診斷試紙的陽性結果圖。 圖4為氮末端腦鈉肽前體/C-反應蛋白/肌鈣蛋白I診斷試紙的陰性結果圖。 圖中1、吸水板，2、硝酸纖維素膜，3、羊抗鼠多克隆抗體控制線，4、試驗線，5、顏 色顆粒固定墊，6、樣品吸液層，7、底板，8、 MAX線。具體實施例1. 合成免疫原的製備(1 )用化學合成方法合成兩種不同結合位點的氮末端腦鈉肽前體合成免疫原；(2) 用化學合成方法合成兩種不同結合位點的C-反應蛋白合成免疫原；(3) 用化學合成方法合成兩種不同結合位點的肌鈣蛋白I合成免疫原。2. 單克隆抗體的製備(1) 將製備的兩種不同結合位點的氮末端腦鈉肽前體合成免疫原免疫BALB/c小鼠。細 胞融合建立瘤株進行篩選，取瘤細胞注射於BALB/c小鼠腹腔，使其產生腹水。提取 小鼠腹水純化篩選，獲得與氮末端腦鈉肽前體分子不同位點結合的兩種氮末端腦鈉 肽前體單克隆抗體I 、氮末端腦鈉肽前體單克隆抗體II;(2) 將製備的兩種不同結合位點的C-反應蛋白合成免疫原分別免疫BALB/c小鼠。用SP20 細胞融合建立瘤株進行篩選，取瘤細胞注射於BALB/c小鼠腹腔，使其產生腹水。提 取小鼠腹水純化篩選，獲得與C-反應蛋白分子不同位點結合的兩種C-反應蛋白單克 隆抗體I 、 C-反應蛋白單克隆抗體II;(3) 將製備的兩種不同結合位點的肌鈣蛋白I合成免疫原分別免疫BALB/c小鼠。用SP20 細胞融合建立瘤株進行篩選，取瘤細胞注射於BALB/c小鼠腹腔，使其產生腹水。提 取小鼠腹水純化篩選，獲得與肌鈣蛋白I分子不同位點結合的兩種肌鈣蛋白I單克隆 抗體I 、肌鈣蛋白I單克隆抗體II;3. 顏色顆粒與單克隆抗體的結合把氮末端腦鈉肽前體單克隆抗體II、 C-反應蛋白單克隆抗體n、肌鈣蛋白i單克隆抗體n標記的顏色顆粒分別吸附到纖維材料上，乾燥後備用。4. 制膜機制膜氮末端腦鈉肽前體單克隆抗體I 、 C-反應蛋白單克隆抗體I 、肌鈣蛋白I單 克隆抗體I包被試驗線，控制線由羊抗鼠多克隆抗體包被。5. 試紙條組合按公知技術組合。6. 使用方法採集全血(靜脈血或指尖血)、血清或血漿。如使用全血標本，請立即使用。不應將標本在室溫條件下長時間放置。如使用血清/血漿標本進行檢測，應儘快分離出血清或血漿，避免溶血。已經溶血的標本不能使用。靜脈血標本在2-8r條件下可以保存兩天，不 能冷凍。血清或血漿標本在2-8'C條件下可以保存兩天。如長期保存需冷凍(-2(TC)。避 免反覆凍融。收集樣本在乾淨的樣杯中，將試紙吸液層端插入樣本中，待測樣本界面請勿超過診斷 試紙上的"MAX"線，10 15分鐘內觀察結果。顯色區為兩條或以上紅色線，則檢測結果為陽性；僅出現一條控制線時為陰性；控制線未出現色帶，表明試紙過期或操作不當，請另取試紙重新檢測。
權利要求1. 一種氮末端腦鈉肽前體/C-反應蛋白/肌鈣蛋白I診斷試紙，其特徵在於它是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、顏色顆粒固定墊(5)、樣品吸液層(6)、MAX線(8)組成，底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條氮末端腦鈉肽前體單抗試驗線(4)、一條C-反應蛋白單抗試驗線(4)、一條心肌鈣蛋白I單抗試驗線(4)和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線(3)，在底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板與顏色顆粒固定墊相互交疊連接，在顏色顆粒固定墊上壓有樣品吸液層。
2. 根據權利要求1所述的氮末端腦鈉肽前體/C-反應蛋白/肌鈣蛋白I診斷試紙，其特徵在於 顏色顆粒可以是一種金屬膠體顆粒，可包括膠體金顆粒、銀顆粒、鐵顆粒、磁性顆粒。
3. 根據權利要求1所述的氮末端腦鈉肽前體/C-反應蛋白/肌鈣蛋白I診斷試紙，其特徵在於 所述的顏色顆粒是一種標記顆粒。
4. 根據權利要求1所述的氮末端腦鈉肽前體/C-反應蛋白/肌鈣蛋白I診斷試紙，其特徵在於 標記顆粒包括染料顆粒、乳膠顆粒、螢光顆粒。
5. 根據權利要求1所述的氮末端腦鈉肽前體/C-反應蛋白/肌轉蛋白I診斷試紙，其特徵在於 所述的硝酸纖維素膜上包被有四條線，三條試驗線， 一條控制線。
6. 根據權利要求1所述的氮末端腦鈉肽前體/C-反應蛋白/肌轉蛋白I診斷試紙，其特徵在於 樣品吸液層由三層材料疊加組成，第一層為一定規格無紡布層、第二層為玻璃纖維層、第 三層為一定規格無紡布層。
專利摘要本實用新型涉及一種氮末端腦鈉肽前體/C-反應蛋白/肌鈣蛋白I診斷試紙，利用快速免疫層析法，定性地檢測臨床標本(全血/血清/血漿)中氮末端腦鈉肽前體、C-反應蛋白、肌鈣蛋白I的診斷試紙。本實用新型是由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、顏色顆粒固定墊、樣品吸液層、MAX線組成，底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條氮末端腦鈉肽前體單抗試驗線、一條C-反應蛋白單抗試驗線、一條肌鈣蛋白I單抗試驗線和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線，在底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板與顏色顆粒固定墊相互交疊連接，在顏色顆粒固定墊上壓有樣品吸液層。
文檔編號G01N33/558GK201096785SQ200720140928
公開日2008年8月6日 申請日期2007年3月30日 優先權日2007年3月30日
發明者萬志強, 萬志靜 申請人:萬華普曼生物工程有限公司