一株高產木豆芪酸的木豆內生真菌菌株及其應用的製作方法

2023-06-10 10:57:51 1

專利名稱：一株高產木豆芪酸的木豆內生真菌菌株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株高產木豆苗酸的木豆內生真菌菌株尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)及其分離方法與發酵生產木豆苗酸的應用，屬於微生物技術應用領域。
背景技術：
植物內生真菌(Endophytic fungi)是指在其生活史的一定階段或全部階段生活於健康植物的各種組織和器官內部的真菌(胡鳳等，2008)。植物內生菌的發現及其相關性質的研究表明，幾乎所有的植物中都伴隨有內生菌的存在，藥用植物內生真菌是一個多樣性十分豐富的生物類群，其產生的次級代謝產物也十分豐富，很多實例證明內生真菌能夠產生與宿主相同或相似的代謝產物(陳立軍等，2006 ;範濤，2010)。 木豆[Cajanus cajan(L. )Millsp.],英文常用名為Pigeonpea。原產東半球,我國熱帶及亞熱帶地區常見栽培。木豆為蝶形花科常綠灌木，是豆科木豆屬一年生或多年生木本植物。木豆作為迄今為止世界上唯一的一種食用木本且用途最多的豆類作物，其根、莖、葉、化、莢全身是寶，綜合價值極高。除具有很高的經濟、生態利用價值外，還具有顯著的藥用價值(谷勇等，2000;陳成斌等，1999;方先蘭等，2002)。木豆提取物中已知的主要活性成分為黃酮類和芪類兩大類化合物(林勵等，1999)，其中，芪類化合物(特別是木豆芪酸)表現出顯著且廣譜的藥理學活性(駱慶峰等，2008 ;中國專利200910071471.0 ;中國專利200910071467. 4 ；Yu Kong et al，2009)。木豆苗酸(Cajaninstilbene acid), 3_輕基4_異戍二烯基5_甲基2_羧基苗酸，簡稱CSA，為天然植物中少見的二羧酸(Cooksey et al，1982)並且被認為是主要的活性物質。CSA對於糖尿病、肝炎、麻疹、痢疾等症狀都有顯著的功效(W.D. Inman et al,2002 ；ff. D. Inman et al, 2003 ；Y. Y. Zheng et al, 2007)並且在抗菌、抗腫瘤及抗氧化等方面具有良好的活性(Yu Konget al,2010 ；Nan Wu et al，2009 ;Xiao_lei Liu et al，2010)。目前，木豆芪酸是直接從木豆葉中分離得到，在提取純化過程中，主要影響因素在於分離過程中耗時長，目的化合物流失大、成本高，並且其原料木豆葉、豆莢等的收集受到時間和空間影響，因此直接利用木豆葉提取CSA的規模化生產與利用受到相應的條件限制，而通過分離得到能產生木豆芪酸的微生物菌株，利用微生物菌株發酵生產木豆芪酸既可避免上述弊端，又易於大規模生產。

發明內容
發明目的與意義本發明的目的與意義在於分離得到一株高產木豆芪酸的木豆內生真菌菌株尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum),並提供其分離方法與在發酵生產木豆苗酸的應用。本發明從利用木豆內生真菌菌株尖孢鐮刀菌發酵生產木豆芪酸的時間短、木豆芪酸產量高，可實現規模化生產，具有較高的應用價值。發明技術解決方案
本發明要解決的問題之一是從木豆葉中分離得到一株高產木豆芪酸的菌株。本發明要解決的問題之二是將上述從木豆葉中分離得到高產木豆芪酸的內生真菌EGE-4菌株應用於生產木豆芪酸。本發明要解決的問題是通過以下方案來達到的本發明通過對一株分離自木豆的內生真菌菌株進行固體培養和液體發酵，獲得了一株能夠通過發酵產生木豆芪酸的木豆內生真菌菌株，菌株號為EGE-4。其分類命名是尖 包鍵刀菌(Fusarium oxysporum)。本發明主要通過以下方法從木豆植株分離得到木豆內生真菌，並獲得上述能產生木豆芪酸的木豆內生真菌菌株(I)取木豆植株，用蒸餾水清洗植株表面，之後依次用75%醫用酒精浸泡30秒、 5%的次氯酸鈉溶液浸泡3分鐘進行表面消毒，滅菌的去離子水衝洗3次；(2)取表面消毒的植物組織，用滅菌的濾紙吸乾其表面的水分後用無菌的剪刀將植物組織分別剪成2X2cm大小的組織塊，用無菌的鑷子將各組織塊接種於PDA培養基表面，置於培養箱中28°C恆溫培養5-7天；(3)待組織塊周圍長出菌落時，挑取邊緣菌絲接種於PDA培養基表面，置於培養箱中28°C恆溫培養5-7天；重複操作過程3-5次，得到純化的菌株；將分離到的菌株編號，接種於PDA斜面，於4°C中保存。經過鑑定，本發明分離得到的木豆內生真菌菌株EGE-4的分類地位屬於半知菌類(Imperfectifungi)、從梗抱目(Moniliales)、瘤座抱科(Tuberculariaceae)、鍵刀菌屬(Fusarium)、尖抱鍵刀菌(Fusarium oxysporum)。本發明木豆內生真菌菌株EGE-4菌株的生物學特徵如下木豆內生真菌菌株EGE-4菌株於28°C、PDA固體培養基上培養，約10天左右長滿平皿(直徑約為9cm)。菌落突起絮狀，菌絲白色質密。菌落粉白色，淺粉色至肉色，略帶有紫色，由於大量孢子生成而呈粉質。菌落高3-5mm，小型分生孢子著生於單生瓶梗上，常在瓶梗頂端聚成球團，單胞，卵形；大型分生孢子鐮刀形，少許彎曲，多數為3隔。厚垣孢子尖生或頂生,球形。木豆內生真菌EGE-4菌株在生產木豆芪酸中的應用，包括(I)菌種活化將所述的木豆內生真菌菌株尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)接種到PDA固體培養基上進行平板培養5-7天；(2)配製發酵培養基去皮切塊的馬鈴薯，煮沸30min，用四層紗布過濾得馬鈴薯汁液，按照每IOg馬鈴薯所得汁液中加入Ig葡萄糖和50mL蒸餾水的比例，加入相應的葡萄糖和蒸餾水，pH自然，分裝於液體搖瓶中，121°C高壓滅菌20min ；(3)發酵培養從步驟⑴的平板中挑取菌塊，接種於步驟⑵的液體搖瓶發酵培養基中進行發酵培養，培養溫度為28°C，轉速120r/min，培養時間10-15天；(4)木豆芪酸的提取將菌絲體和發酵液分離，棄去菌絲體，用等體積的乙酸乙酯與發酵液進行萃取，得到萃取液，將有機相減壓濃縮，即得木豆芪酸提取物。採用本發明木豆內生真菌EGE-4菌株進行發酵，每升發酵液中可獲得木豆芪酸
0.945-1. 042mgo本發明的優點
本發明從利用木豆內生真菌菌株尖孢鐮刀菌發酵生產木豆芪酸的時間短、木豆芪酸產量高，可實現規模化生產，具有較高的應用價值。
具體實施例方式實施例II.培養基配製及培養條件馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基)去皮切塊的馬鈴薯200g，煮沸30min，用四層紗布過濾得馬鈴薯汁液，所得汁液中加入20g葡萄糖、20g瓊脂粉，加蒸餾水至IOOOmL,pH自然，121°C高壓滅菌20min ；液體發酵培養基去皮切塊的馬鈴薯200g，煮沸30min，用四層紗布過濾得馬鈴薯汁液，所得汁液中加入20g葡萄糖，加蒸餾水至lOOOmL，pH自然，121°C高壓滅菌20min無菌操作條件所有器皿和用具須經121°C高壓滅菌20min，菌種分離、接種等操作均在超淨工作檯內進行。培養條件①平板培養菌塊放置於培養皿的中心位置進行平板培養，28°C恆溫培養7天。②液體發酵培養菌塊接入液體發酵培養基中，轉速為120r/min，培養溫度28°C，培養時間12天。2.木豆內生真菌的分離、純化及鑑定(I)木豆內生真菌EGE-4的分離①取木豆植株，用蒸餾水清洗植株表面，之後依次用75%醫用酒精浸泡30秒、5%的次氯酸鈉溶液浸泡3分鐘進行表面消毒，滅菌的去離子水衝洗3次；②取表面消毒的植物組織，用滅菌的濾紙吸乾其表面的水分後用無菌的剪刀將植物組織分別剪成2 X 2cm大小的組織塊，用無菌的鑷子將各組織塊接種於PDA培養基表面，置於培養箱中28°C恆溫培養7天；(2)木豆內生真菌EGE-4的純化待組織塊周圍長出菌落時，挑取邊緣菌絲接種於PDA培養基表面，置於培養箱中 28°C恆溫培養7天；重複操作過程3次，得到純化的菌株；將分離到的菌株編號，接種於PDA斜面，於4°C中保存。(3)木豆內生真菌EGE-4的生物學特徵木豆內生真菌菌株EGE-4菌株於28°C、PDA固體培養基上培養，約10天左右長滿平皿(直徑約為9cm)。菌落突起絮狀，菌絲白色質密。菌落粉白色，淺粉色至肉色，略帶有紫色，由於大量孢子生成而呈粉質。菌落高3-5mm，小型分生孢子著生於單生瓶梗上，常在瓶梗頂端聚成球團，單胞，卵形；大型分生孢子鐮刀形，少許彎曲，多數為3隔。厚垣孢子尖生或頂生,球形。 3.木豆內生真菌EGE-4菌株發酵木豆芪酸(I)菌種活化將所述的木豆內生真菌菌株尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)接種到PDA固體培養基上進行平板培養7天；(2)配製發酵培養基去皮切塊的馬鈴薯200g，煮沸30min，用四層紗布過濾得馬鈴薯汁液，所得汁液中加入20g葡萄糖，加蒸餾水至lOOOmL，pH自然，121 °C高壓滅菌20min ；
(3)發酵培養從步驟⑴的平板中挑取菌塊，接種於步驟⑵的液體搖瓶發酵培養基中進行發酵培養，培養溫度為28°C，轉速120r/min，培養時間12天；(4)木豆芪酸的提取將菌絲體和發酵液分離，棄去菌絲體，用等體積的乙酸乙酯與發酵液進行萃取，得到萃取液，將有機相減壓濃縮，即得木豆芪酸提取物。採用本發明木豆內生真菌EGE-4菌株進行發酵，每升發酵液中可獲得木豆芪酸
0.945-1. 042mg。本發明從利用木豆內生真菌菌株尖孢鐮刀菌發酵生產木豆芪酸的時間短、木豆芪酸產量高，可實現規模化生產，具有較高的應用價值。


圖I木豆芪酸的結構式
圖2木豆內生真菌EGE-4菌落形態3木豆內生真菌EGE-4在光學顯微鏡下的孢子形態圖。
權利要求
1.一株高產木豆苗酸的木豆內生真菌菌株尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)及其分離方法與發酵生產木豆芪酸的應用，其特徵在於所述尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum) EGE-4,為半知菌類(Imperfecti fungi)、從梗抱目(Moniliales)、瘤座抱科(Tuberculariaceae)、鍵刀菌屬(Fusarium)。
2.按照權利要求I所述的一株高產木豆芪酸的木豆內生真菌菌株尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)及其分離方法與發酵生產木豆苗酸的應用，其特徵在於所述的尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的菌落粉白色,淺粉色至肉色,略帶有紫色,菌絲白色質密，小型分生孢子著生於 單生瓶梗上，常在瓶梗頂端聚成球團，單胞，卵形；大型分生孢子鐮刀形，少許彎曲，多數為3隔，厚垣孢子尖生或頂生，球形。
3.按照權利要求I所述的一株高產木豆芪酸的木豆內生真菌菌株尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)及其分離方法與發酵生產木豆苗酸的應用，其特徵在於所述的尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的分離方法,包括以下步驟 (1)取木豆植株，用蒸餾水清洗植株表面，之後依次用75%醫用酒精浸泡30秒、5%的次氯酸鈉溶液浸泡3分鐘進行表面消毒，滅菌的去離子水衝洗3次； (2)取表面消毒的植物組織，用滅菌的濾紙吸乾其表面的水分後用無菌的剪刀將植物組織分別剪成2 X 2cm大小的組織塊，用無菌的鑷子將各組織塊接種於PDA培養基表面，置於培養箱中28 °C恆溫培養5-7天； (3)待組織塊周圍長出菌落時，挑取邊緣菌絲接種於PDA培養基表面，置於培養箱中28°C恆溫培養5-7天；重複操作過程3-5次，得到純化的菌株；將分離到的菌株編號，接種於PDA斜面，於4°C中保存。
4.權利要求I所述的一株高產木豆芪酸的木豆內生真菌菌株尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)及其分離方法與發酵生產木豆苗酸的應用，其特徵在於所述的尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)在發酵生產木豆苗酸中的應用，包括以下步驟 (1)菌種活化將所述的木豆內生真菌菌株尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)接種到PDA固體培養基上進行平板培養5-7天； (2)配製發酵培養基去皮切塊的馬鈴薯，煮沸30min，用四層紗布過濾得馬鈴薯汁液，按照每IOg馬鈴薯所得汁液中加入Ig葡萄糖和50mL蒸餾水的比例，加入相應的葡萄糖和蒸餾水，pH自然，分裝於液體搖瓶中，121°C高壓火菌20min ； (3)發酵培養從步驟(I)的平板中挑取菌塊，接種於步驟(2)的液體搖瓶發酵培養基中進行發酵培養，培養溫度為28°C，轉速120r/min，培養時間10-15天； (4)木豆芪酸的提取將菌絲體和發酵液分離，棄去菌絲體，用等體積的乙酸乙酯與發酵液進行萃取，得到萃取液，將有機相減壓濃縮，即得木豆芪酸提取物。
全文摘要
本發明公開了一株高產木豆芪酸的木豆內生真菌菌株尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)及其分離方法與發酵生產木豆芪酸的應用。該尖孢鐮刀菌菌株(EGE-4)來源於木豆植株，通過固體培養、分離純化得到。發酵培養該菌株能夠高產木豆芪酸，每升發酵液中可獲得木豆芪酸0.945-1.042mg。本發明尖孢鐮刀菌菌株(EGE-4)為首次從木豆中獲得的內生真菌，利用該菌株生產木豆芪酸的時間短、產量高，易於實現規模化生產，應用前景廣闊。
文檔編號C12P7/42GK102732428SQ20111009152
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月13日 優先權日2011年4月13日
發明者付玉傑, 祖元剛, 羅猛, 趙晉彤, 顧成波, 高原 申請人:東北林業大學, 付玉傑