一種包括酵母細胞中表達的hpv16型l1和e7靶抗原的嵌合蛋白疫苗及其製備方法
2023-06-10 12:11:51 1
專利名稱：一種包括酵母細胞中表達的hpv16型l1和e7靶抗原的嵌合蛋白疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物醫學技術領域，特別是生物疫苗技術領域，涉及利用HPV16L1、HPV16E7的嵌合型蛋白為靶抗原，適當比例配伍，製備HPV疫苗，用於預防HPV弓丨起的部分疾病。
背景技術：
子宮頸癌是婦女常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次於乳腺癌，位居 女性惡性腫瘤第二。據世界範圍內統計，每年約有50萬宮頸癌新發病例，每天有600名婦女死於宮頸癌，其中80%在發展中國家。我國每年約新發病例13. 15萬，佔世界新發病例的1/3。大量研究資料表明高危險人乳頭瘤狀病毒(HPV)感染是引發宮頸癌的重要原因之一。HPV是一種嗜黏膜和皮膚上皮DNA病毒，20世紀70年代發現宮頸癌的發生與HPV有關，20世紀80年代宮頸癌活組織檢查發現HPV16。HPV感染大多數由低危型的如HPV-6和HPV-Il感染，造成良性生殖器疣；而高危型HPV與肛門及生殖器區域的癌前病變及惡性病變有關。對多數患者來說，生殖道HPV存留可達年，直到出現另一新型別的HPV感染才自然消退研究顯示，HPV16和HPV18會存留更長時間周期持續HPV感染是宮頸上皮。近年來宮頸癌發病出現年輕化趨勢，這主要與HPV感染增多有關。因此，研發安全、有效、經濟的宮頸癌疫苗迫在眉睫，具有重大的經濟學價值和社會意義。研究證明90%左右的宮頸癌的組織可以檢測到HPV16亞型，HPV16型與鱗癌有著密切關係，而90%的宮頸癌為鱗癌，所以HPV16是女性宮頸癌發病的主要原因。巴斯德畢赤酵母表達系統是現目前廣泛應用的異源蛋白真核表達系統，其具有穩定性好、表達高效、分泌量大、規模化容易和成本低廉等優點，且具有糖基化等翻譯後修飾功能。HPV晚期基因編碼的主要結構蛋白LI及次要蛋白L2構成了病毒衣殼，二者比例約5 I。單獨的LI蛋白可以自發組裝成直徑與HPV成熟病毒大小相近(約55nm)的VLPs，VLPs和天然HPV病毒的形態相似，都是二十面體結構，只是VLP內部無病毒核酸。L1、L2蛋白既是病毒的主要抗原成分，也是與細胞受體結合的位點所在。E7蛋白是HPV16的一種重要的腫瘤排斥抗原，E7蛋白的表位主要集中於第I 60個胺基酸之間。病毒樣顆粒(VLPs)是不含核酸的空殼蛋白，形態上天然的病毒顆粒相似，具有很強的免疫原性和生物學活性。人類乳頭狀瘤病毒(HPV) 16型早期蛋白E7被證實不僅對細胞惡性轉化和維持惡性過程起著關鍵作用，而且還是腫瘤排斥抗原。因此，阻止腫瘤形成的E7疫苗已成為近年研究熱點。疫苗防治HPV相關疾病是近幾年來的研究熱點。由於目前無法通過組織培養獲得大量的HPV病毒，並且考慮到HPVE6、E7基因的潛在致癌性，因此，不能通過減毒活疫苗或滅活疫苗等傳統疫苗製備方式獲得HPV疫苗。伴隨分子生物學和基因工程技術的發展，目前HPV疫苗研究主要集中在VLPS疫苗、重組病毒疫苗、亞單位疫苗等。VLPS疫苗主要是以HPV衣殼蛋白LI為首選目的蛋白，HPVLI蛋白分別在原核表達系統、酵母表達系統和杆狀病毒表達系統中得以表達，且可自組裝成VLPS，其動物實驗及部分臨床實驗結果表明LI蛋白裝配成的VLPs具有良好的免疫原性。全世界流行病學總體調查研究結果表明，HPV引起惡性腫瘤的型別在世界各地不盡相同。其中HPV16是最主要的致癌因素，其他型別在世界各地與腫瘤發生的相關性不同。HPV16和HPV18型在各大洲的流行型別佔65 75%左右，為HPV感染的主要型別，也是目前兩種HPV疫苗組份型別，其他型別表現的差異較大。
發明內容
要解決的技術問題
本發明的目的之一是提供一種兼有治療、預防人乳頭瘤病毒引起的疾病的新疫苗；本發明的另一目的是提供製備上述疫苗的方法，以及所述疫苗用於預防和治療由HPV16弓丨起的感染和疾病的藥物中的應用，其中所述的感染和疾病包括子宮頸癌、尖銳溼疣、乳腺癌、支氣管肺癌、直腸癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮膚癌及其它與HPV密切相關的疾病。本發明的包含由在畢赤酵母中表達的人乳頭瘤病毒16型病毒的重組蛋白L1E7的疫苗，是利用基因工程技術將人乳頭瘤病毒16型的主要衣殼蛋白LI的免疫活性部分和早期基因E7的免疫活性部分融合構建為融合基因L1E7，並將該融合基因在畢赤酵母細胞中表達而得到重組蛋白，將獲得的重組蛋白與佐劑混合，製備出疫苗，所加佐劑為氫氧化鋁。本發明製備疫苗的方法包括設計引物克隆HPV16LI/E7基因及構建真核表達質粒；將構建成功的真核表達質粒轉化酵母菌株，篩選穩定高效分泌表達菌株；發酵並誘導表達目的蛋白；純化目的蛋白；將純化的重組蛋白製成疫苗的步驟，其中在甲醇濃度為1.0%，pH為6. O條件下誘導酵母菌株表達重組蛋白，所採用的真核表達質粒是pPIC9k-Ll/E7，酵母菌株是畢赤酵母菌株，優選為畢赤酵母組氨酸缺陷型GS115菌株,真核表達質粒轉化酵母菌株的方法是電轉化，所使用的引物是根據GenBank中HPV16的全序列設計的LI上遊、LI下遊、E7上遊、E7下遊引物。在pH = 6. O、溫度28 30°C振搖培養畢赤酵母組氨酸缺陷型GS115菌株48h，然後每隔24h添加終濃度為1%的甲醇誘導重組蛋白表達，96h後收樣。收樣後，對樣品進行離心，用玻璃珠破碎細胞沉澱，然後14000r/min離心2min，收集上清，接著從上清液中純化目的蛋白。將純化的重組蛋白製成疫苗包括向純化的重組蛋白中加入終濃度約為lmg/ml的佐劑氫氧化鋁，充分混合，於4°C保存即得半成品。技術方案本發明採用基因工程技術，用PCR及基因克隆的方法將HPV16的衣殼蛋白LI活性位點與E7早期基因的主要抗原活性位點融合，再將構建的融合基因插到表達載體pPIC9k中，高效表達L1-E7重組蛋白，純化後得到的VLPs，將其與佐劑混合，製備出能兼有預防、治療人乳頭瘤病毒感染的疫苗。本發明具有如下優點1)以HPV16L1、HPV16E7為靶抗原，兼有預防、治療人乳頭瘤病毒感染的疾病，如宮頸癌、尖銳溼疣。2)酵母細胞可實現大規模發酵，用畢赤酵母表達系統(P.Pichia)，相比用杆狀病毒-昆蟲表達系統，操作簡單，大大降低成本。3)純化工藝相對簡單、成本低、適於大規模生產。純化收率高，使此疫苗在發展中國家的應用可能性更高，具有顯著的經濟效益和社會效益。
具體實施例方式
例I本發明的目的是這樣實現的(I)處理臨床樣品刮取宮頸表層細胞，離心，用適宜的緩衝液洗滌離心，沉澱備用。若不立即使用，必須存儲於-70°C冰箱或者液氮。(2)參考Genbank，從臨床樣品中分離HPV基因組DNA，確定代表性HPV野生型序列。考慮用酚抽提法將細胞懸浮於含有EDTA、SDS和RNAase的抽提液中，然後用蛋白酶K與SDS發生協同作用破碎細胞膜，用酚、氯仿使蛋白變性，去雜質。最後用乙醇沉澱基因組DNA。(3)克隆 HPV16LI/E7 基因及構建質粒 pPIC9k_Ll/E7a)引物設計根據GenBank中HPV16的全序列設計引物，LI上遊引入6*his標籤及SnaBI酶切位點，下遊引入HindIII酶酶切位點；E7上遊引入HindIII酶切位點，下遊引入Not I酶切位點。如下LI 上遊 5，CC TACGTA CATCATCATCATCATCAT CAGGTGACTTTTATT3，LI 下遊 5，CCC AAGCTT CAGCTIACGTTTTTTGCGTTTAGC3』E7 上遊 5，CCCAAGCTT ATGCATGGAG ATACACCTAC3』E7 下遊 5，ATAAGAAT GCGGCCGC TTATGGTTTCTGAGAACAGATG3，b)基因擴增①LI的擴增體系與參數HPV16cDNA2ul
LI上遊引物Iul
LI下遊引物Iul
Primerstar 高保真酶 Iul 5 xPSBufFer5ul
dNTP4ul
ddH2036ul, 總體積 50ul上PCR儀進行擴增，具體參數為①94 °C 5min②94 °C 45s，54°C 45s, 72 °C2min ③ 72°C IOmin0②E7的擴增體系與參數HPV16cDNA2ul
E7上遊引物Iul
E7下遊引物Iul
Primerstar 高保真酶 Iul 5 xPSBufFer5ul
dNTP4ul
ddH2036ul, 總體積 50ul上PCR儀進行擴增，具體參數為①94 °C 5min②94°C 45s, 52 °C 45s, 72 °C2min③72°C IOmin0擴增產物進行I %的瓊脂糖凝膠電泳，得到正確的條帶後，進行膠回收。c)擴增產物的回收將凝膠中的正確條帶用手術刀在紫外燈下切下，移入EP管中，用凝膠回收試劑盒進行回收。d)pPIC9k-Ll/E7重組子的構建與質粒提取①大腸桿菌DH5a感受態細胞的製備②LI回收產物經SnaBI和HindIII酶切，E7經HindIII和Not I酶切，跑膠，用HiBindTM凝膠回收試劑盒進行回收，連接。
LI基因5ul
E7基因5ul
T4連接酶Iul
10xT4Buffer2ul
ddH207ul, 總體積 20ul16°C水浴5小時。pPIC9k經SnaBI和Not I酶切，經Ecor I和Not I酶切，跑膠後回收。pPIC9k3ulLI/E77ul
T4連接酶Iul
10xT4Buffer 2ul
ddH207ul, 總體積 20ul16°C水浴5小時。 把連接產物加入做好的DH5 α中，冰浴30min，42°C 90s，冰浴3min，加入500ul的LB液體培養基，37°C震蕩培養I小時，室溫離心5min吸去500ul的上清，餘液混勻，餘液均勻塗布於氨苄抗性的LB平板，37 「C過夜。③鹼裂解法大規模提取質粒e)質粒的線性化pPIC9k-Ll/E7 經 Sall 酶切，體系為質粒3 Oul
Sail2ul
IOxHBufFer5ulddH2013ul, 總體積 50ul酶切4小時，回收往酶切體系裡加入等體積的酚氯仿抽提，取上清約80ul，加入2倍體積的無水こ醇和0. I倍體積的pH5. 2的醋酸鈉，置於_20°C半小時，13000rmp 20min,棄去上清；75%的こ醇300ul洗兩遍，13000rmp 5min,棄去上清,乾燥後加35ul的ddH20溶解。(4)將構建成功的真核表達質粒pPIC9k_Ll/E7轉化畢赤酵母，篩選穩定高效分泌表達菌株a)畢赤酵母感受態的製備及電轉化i、畢赤酵母感受態的製備①挑取酵母單菌落，接種至含有5ml YH)培養基的50ml三角瓶中，30°C、250 300r/min培養過夜；②取100 500 ill的培養物接種至含有500ml新鮮培養基的2L三角搖瓶中，28 300C >250 300r/min 培養過夜，至 0D600 達到 I. 3 I. 5 ;③將細胞培養物於4°C，1500g離心5min，用500ml的冰預冷的無菌水將菌體沉澱
重懸；④按步驟3離心,用250ml的冰預冷的無菌水將菌體沉澱重懸；⑤按步驟3離心，用20ml的冰預冷的Imol的山梨醇溶液將菌體沉澱重懸；⑥按步驟3離心，用Iml的冰預冷的Imol的山梨醇溶液將菌體沉澱重懸，其終體積約為I. 5ml ;將處理好的酵母菌按每份SOul分裝到滅菌的EP管中，_80°C凍藏ii、畢赤酵母的電轉化取新鮮製備的(或_80°C凍存的)感受態細胞置於冰浴中，使其完全解凍①將80ul菌體移出至一新的無菌Eppendorf管中，加入5_20ug線性化質粒(5-10ul)，輕彈混勻，盡數吸出轉移到0. 2cm型的電穿孔轉化杯中；②轉化杯置於冰浴中5 10分鐘，保持低溫。③電穿孔轉化電擊條件電壓1509V ;電阻:200 Q ;電容25uF ;脈衝時間:10ms ；
一次電擊。④電擊後，馬上在電擊轉化杯中加入Iml 4°C預冷的頂的山梨醇溶液,用微量移液槍吹打均勻，置於冰浴中；⑤取30°C烘至表面半乾的含葡萄糖(MD)培養基平板，在超淨工作檯上無菌操作塗布平板，400uF/板；將塗好的平板置於30°C正面放置至表面半乾，然後倒置培養，4天後觀察轉化子情況。b)重組酵母GS 115陽性轉化子的高拷貝外源基因整合篩選①將陽性轉化子在含葡萄糖(MD)平板培養板形成的克隆菌，點種在G418濃度在3g/L的YPD培養板上，30°C培養3-4d，篩選鑑定高拷貝外源基因整合菌株。得到陽性克隆菌株(即GSl 15高表達菌)，將鑑定結果為陽性的菌株接種在不含G418的YPD培養基進行擴增，並加甘油後放_70°C冰凍保存菌株。②鑑定表型篩選出的轉化子需鑑定表型，即確定是甲醇利用正表型Mut+還是甲醇利用慢表型Muts。這兩種不同表型在誘導表達的件上有差異。可以把轉化子同時點在含葡萄糖(MD)平板和含甲醇(MM)平板上。在MD和麗板上生長差別不大的轉化子為Mut+(能夠快速利用甲醇為碳源)；相反，在MD上生長快，MM上生長很慢的轉化子為Muts (不能利用甲醇為碳源)。(5)目的蛋白的規模化發酵a)種子液的製備取已保存的GS115高表達菌，YH)板上劃線。於28°C培養約72h，看到菌落長至直徑2. 5mm左右，挑單菌落接種於含5ml BMGY培養液的50ml離心管中，於28°C振蕩培養36h左右，至0D600 = 2-6。將上述菌液按0. 1% (v/v)接種於含IL BMGY培養液5L三角搖瓶中，於28°C振蕩培養36h左右至0D600 = 2_6。b)發酵罐高壓滅菌往100L發酵罐內加入40L FM21培養液，打開電源、蒸汽及冷卻閥門，將控制面板調至滅菌狀態，設定好滅菌溫度為121°C，時間為30min，Control設為打開狀態。在高壓滅菌時，轉速、pH、溶氧、通氣全部為關閉狀態。發酵罐以P-I-D閉環控制程序自動升溫、高壓和降溫。c)接種高溫滅菌後發酵罐溫度要降至28°C，用氨水調pH值至6.0，加入無菌的40ml PTMI微量元素和18ml Biotin貯備液。用酒精棉將搖瓶的瓶ロ消毒後，將2L的種子液加入發酵罐，設定轉速600rmp/min、溫度28°C、pH6. 0,通氣,壓カ2km/cm2。d)發酵階段i、生長階段只加甘油，①甘油批式階段②甘油補料階段ii、表達階段③甲醉補料誘導階段姆隔24h以7. 2ml/h/L的速度添加終濃度為1%的甲醇誘導，96h後收樣，離心，細胞沉澱進行玻璃珠破碎後，14000r/min離心2min，取上清。(6)目的蛋白的純化上清經純化通過離子交換，親和，蛋白的透析復性及濃縮，等多種層析方法純化表達的重組蛋白。通過SDS-PAGE電泳檢測每步結果並控制最終產品質量。①離子交換層析將上清加入已用緩衝液平衡的離子交換柱上，用加了 IOOmM氯化鈉緩衝液以Iml/min的流速洗脫。 ②親和層析將從離子交換得到的樣品調PH至8. 0，然後加入用緩衝液平衡過的Ni-NTA親和層析柱，用含咪唑的緩衝液以lml/min的流速洗脫,收集目的蛋白。③蛋白的透析復性及濃縮
i、蛋白的透析將最後洗脫的蛋白置於處理好的透析袋中密封，放入100倍體積的含有尿素的透析液中，每6小時更換透析液，經4、2、I、0M的尿素梯度進行透析，最後透析到磷酸緩衝鹽溶液中。ii、蛋白的濃縮
將透析好的蛋白取出離心(12000rmp 20分鐘，4°C )取上清重新用透析袋密封好，埋於聚こニ醇(PEG 8000)顆粒中，待其濃度至初體積的1/3時取出，將蛋白離心(12000rmp20分鐘，4°C )取上清，分裝儲存。(7)將純化的重組蛋白按製成疫苗，同時加入佐劑氫氧化鋁，終濃度約為lmg/ml，充分混合後，於4°C保存。本發明疫苗製備エ藝的重組蛋白生產收率開啟I支工作種子按每100L大罐培養量計可製造出粗製多糖5mg。實施例2 PCR鑑定重組子用LI上遊引物和E7下遊引物以提取的酵母基因組為模板擴增，得到結果，說明重組酵母菌GS 115幣pPIC9k-Ll/E7構建成功。實施例3重組酵母GS 115陽性轉化子的高拷貝外源基因整合篩選鑑定挑選單個陽性菌落，按試劑盒說明提取酵母GS 115菌轉化的基因組DNA作為模板，用pPIC9k-Ll/E7構建引物及條件進行PCR擴增篩選，PCR產物經加核酸染料的瓊脂糖凝膠電泳分析。實施例4重組蛋白HPV16LI/E7的表達優化試驗中分別從誘導時間、甲醇誘導濃度、培養基pH值三方面優化表達。首先分別在6、12、24、36、48、60和72h七個時間點取樣跑SDS-PAGE電泳檢測表達量，結果顯示48小時時外源蛋白表達量最高；然後取七個搖瓶分別按0,0. 2%,0. 4%,0.6%,0.8%U.0%^PI. 2%的終濃度添加甲醇，SDS-PAGE電泳檢測表達量，結果顯示甲醇濃度在I. 0%的時候外源蛋白的表達量最高；分別在培養基PH值為4. 0,5.0,6.0,7. O、8. 0條件下誘導表達目的蛋白，SDS電泳檢測，結果是外源蛋白在pH為6.0的時候表達量最大。因此得出將陽性轉化菌於pH = 6. O、溫度28 30°C振搖培養48h，然後每隔24h添加終濃度為I %的甲醇誘導，96h後收樣，離心，細胞沉澱進行玻璃珠破碎後，14000r/min離心2min，取上清的方式最優。實施例5 SDS-PAGE和Western-blot電泳檢測表達產物及表達量的檢測將最初在MD(含G4180. 5mg/ml)培養基上長出的轉化子，通過G418濃度梯度0. 5、l、2mg/ml的篩選，最後得到G418抗性菌株I個。經甲醇誘導的重組菌離心後取上清跑SDS-PAGE電泳,在64KD左右出現蛋白條帶，與推導的蛋白條帶大小一致。Westem_blot結果顯示，HPV16型pPlC9k-LI/E7融合蛋白得到成功表達並在64KD處出現特異的條帶，與推導的蛋白條帶大小一致，說明在畢赤酵母表達系統中成功的表達了 pPlcgk-Ll/E7蛋白。經Tanon4100分析儀檢測化學光密度，重組疫苗中HPV16LI/E7蛋白表達量為50ng/ul。實施例6重組蛋白的Western-blot鑑定a)通過Western-blot驗證目標蛋白正確性。細胞裂解後上清經12% SDS-PAGE後直接進行考馬斯亮藍染色，並轉移至NC膜，進行Western blot分析，分別以抗-HPV16L1和E7單抗(I 3000)為ー抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為ニ抗(I 5000)，Dons/TMB工作液顯色後終止反應。 b)重組蛋白結構電鏡分析將L1E7重組蛋白樣品放在銅網/碳網上，用2%磷鎢酸負染，在電子顯微鏡下觀察到重組蛋白均能自動環化成ー個50nm的環形顆粒結構,且形態和結構與天然HPVLl完全相同，即為病毒樣顆粒。實施案例7重組蛋白的動物免疫實驗(I)重組蛋白免疫小鼠血清抗體檢測重組蛋白與相同體積的佐劑充分混合，呈乳化液，對照組為佐劑和相同體積的PBS，小鼠左側腹股溝皮下注免疫小鼠，ニ周后加強ー針，再過ニ周取血清用酶聯免疫法分別檢測L1E7抗體水平。誘發產生滴度為I : 的L1\E7抗體。表達的重組蛋白能對小鼠能長時間產生體液免疫。(2)重組蛋白抗腫瘤移植實驗a)腫瘤預防免疫實驗重組蛋白+佐劑和佐劑+PBS接種小鼠，每組20隻，注射小鼠腹股溝，每周注射一次，共8周，第8此免疫後對小鼠進行接種腫瘤細胞2X IO6個。觀察腫瘤生長情況三個月，免疫了重組蛋白疫苗的那組，腫瘤生長緩慢質量小，而佐劑對照組生長快、質量大。b)腫瘤治療免疫實驗小鼠注射2 X IO5細胞，觀察腫瘤生長情況三個月，分2組，每組20隻，每隻小鼠背部皮下注射IOug重組蛋白+佐劑和佐劑+PBS，每周注射一次，共8周。可見小鼠免疫了重組蛋白疫苗的一組得到較明顯的抑制腫瘤發展的效果，而注射PBS的一組沒有抑瘤作用。
權利要求
1.製備包含由在酵母中表達的人乳頭瘤病毒16型病毒的重組蛋白L1E7的疫苗的方法，其包括設計引物克隆HPV16LI/E7基因及構建真核表達質粒；將構建成功的真核表達質粒轉化酵母菌株，篩選穩定高效分泌表達菌株；發酵並誘導表達目的蛋白；純化目的蛋白；將純化的重組蛋白製成疫苗的步驟，其特徵在於，在甲醇濃度為1.0%，pH為6. O條件下誘導酵母菌株表達重組蛋白。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於克隆HPV16LI/E7基因的引物為LI 上遊 5，CC TACGTA CATCATCATCATCATCAT CAGGTGACTTTTATT3，；LI 下遊 5，CCC AAGCTT CAGCTIACGTTTTTTGCGTTTAGC3，；E7 上遊 5』 CCCAAGCTT ATGCATGGAG ATACACCTAC3』E7 下遊 5，ATAAGAAT GCGGCCGC TTATGGITTCTGAGAACAGATG3，。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於其中的真核表達質粒是pPIC9k-Ll/E7。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於其中的酵母菌株是畢赤酵母菌株。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於酵母菌為畢赤酵母組氨酸缺陷型GSl15菌株。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於真核表達質粒轉化酵母菌株的方法是電轉化。
7.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，在pH= 6. O、溫度28 30°C振搖培養畢赤酵母組氨酸缺陷型GSl 15菌株48h，然後每隔24h添加終濃度為I %的甲醇誘導重組蛋白表達，96h後收樣。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，收樣後，對樣品進行離心，用玻璃珠破碎細胞沉澱，然後14000r/min離心2min，收集上清，接著從上清液中純化目的蛋白。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，將純化的重組蛋白製成疫苗包括向純化的重組蛋白中加入終濃度約為lmg/ml的佐劑氫氧化鋁，充分混合，於4°C保存。
10.權利要求9的方法製備得到的疫苗在製備用於預防和治療由HPV16引起的感染和疾病的藥物中的應用，其中所述的感染和疾病包括子宮頸癌、尖銳溼疣、乳腺癌、支氣管肺癌、直腸癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮膚癌及其它與HPV密切相關的疾病。
全文摘要
本發明提供一種L1衣殼蛋白和E7多肽組成的L1E7嵌合蛋白疫苗及其製備方法。本發明採用優化的誘導表達條件，用酵母細胞進行大規模發酵來表達嵌合蛋白，能夠大大降低成本；而且，採用的純化工藝相對簡單、成本低、適於大規模生產HPV16L1/E7蛋白。含晚期結構基因和早期基因的HPV16L1/E7蛋白，除能使機體產生中和抗體外，還能誘導機體產生較強的E7特異性C TL反應和抗腫瘤活性，被認為是最有前景的宮頸癌預防、治療性疫苗，能用於已有HPV16感染的、有或沒有臨床症狀的病人。
文檔編號C12R1/84GK102614505SQ201110382080
公開日2012年8月1日 申請日期2011年11月25日 優先權日2011年11月25日
發明者侯文禮, 馮曉, 劉瑾, 趙志鵬, 鍾澤榮 申請人:成都康華生物製品有限公司