一株產耐高溫高鹽脂肽的枯草芽孢桿菌th-2及其用途

2023-06-21 03:24:36

一株產耐高溫高鹽脂肽的枯草芽孢桿菌th-2及其用途
【專利摘要】一株產耐高溫高鹽脂肽的枯草芽孢桿菌TH-2及其用途。本發明菌株是從勝利油田油水井樣品中通過血平板和擴油圈方法篩選得到，並通過耐溫耐鹽性能考察反覆篩選傳代獲得，其命名為Bacillus subtilis.TH-2，其保藏編號為CGMMCC No.8695。該菌培養基為葡萄糖20g/L，尿素3g/L，酵母粉1g/L，磷酸氫二鉀3g/L，氯化鈉5g/L，pH值為7.0～7.5。本發明提供的TH-2菌好氧、最適生長溫度37～50℃、生長pH值範圍4～9、最佳生長pH範圍7.0～7.5、NaCl的耐受性0～3％。該菌發酵生產的脂肽類表面活性劑性能為耐溫150℃、耐鹽15×104mg/L、乳化指數大於80％、表面張力最低27mN/m、物理模擬實驗提高採收率大於12％。該菌株發酵液和發酵液的粗提產品現場試驗提高採收率分別大於5.0％和8.0％。因此，本發明提供的TH-2菌發酵生產的酯肽類表面活性劑可廣泛地應用於提高原油採收率的現場試驗中。CGMCC No86952014.01.09
【專利說明】一株產耐高溫高鹽脂肽的枯草芽孢桿菌TH-2及其用途 一、

【技術領域】
[0001] 本發明屬於微生物生物技術和環境生物【技術領域】，具體地說，它涉及一株枯草芽 孢桿菌Baci I lus subti I i s. TH-2菌株及其在微生物採油中的應用。 二、

【背景技術】
[0002] 在能源日趨緊張的情況下，提高石油採收率已成為石油開採研究的焦點，近年來 三次採油技術日益得到廣泛重視和現場應用，因此，三次採油驅油劑的研發也越來越引起 科研工作者的關注，現在常用的驅油劑主要以化學表面活性劑，如：石油磺酸鹽、烷基苯磺 酸鹽和石油羧酸鹽等。
[0003] 目前，石油開採中驅油劑以化學表面活性劑為主，但由於化學表面活性劑耐溫耐 鹽性能與油藏適應性差，產量降低，生產成本較高，環境汙染，表/界面活性較差等問題，因 此在一定程度上限制了其在現場應用。
[0004] 生物表活劑與化學表活劑相比具有如下優勢：首先，它們與一般的表面活性劑分 子在結構上相似，在分子中不僅有脂肪烴鏈構成的非極性憎水基，而且含有極性的親水基， 但生物表面活性劑通常比合成表面活性劑擁有更為複雜和龐大的分子結構，單個分子佔據 更大的空間，而顯示較低的臨界膠團濃度；其次，它們能顯著地降低表面張力、改善界面性 質，在極端苛刻條件下仍具有良好的選擇性和專一性，相容性好，無毒，能被微生物降解， 因此具備高效、環保的特性，並且不以石油為原料，在石油開採、環境治理等領域應用越來 越廣泛。特別是在石油開採過程中可以直接利用微生物發酵液，省去分離純化過程，因而可 大幅度降低成本，較石化產品有明顯的價格優勢。 三、


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtil is) TH-2菌株和該菌在微生物採油中的應用。
[0006] 本發明提供的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)TH-2菌株，以下簡稱TH-2,於 2014年1月9日保藏於"中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"（北京市朝陽 區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所），其保藏編號為CGMCC No. 8695。
[0007] 本發明提供的枯草芽孢桿菌TH-2CGMCC No. 8695菌株，是從勝利油田油水井樣品 中通過血平板和擴油圈方法篩選得到，並通過耐溫耐鹽性能考察反覆篩選傳代獲得。
[0008] 枯草芽孢桿菌TH-2CGMCC No. 8695的形態學特性：在好氧固體培養基下 培養1?2天出現大小一般為0.5?LOmm乳白色菌落，細胞形態為短杆狀，大小 2-5 UmX 0· 5-1. Oum0
[0009] 枯草芽孢桿菌TH-2CGMCC No. 8695的生理生化特性：好氧，生長溫度37?50°C， 生長pH值範圍4?9,最佳生長pH範圍7?7. 5, NaCl的耐受性0?3%。
[0010] 枯草芽孢桿菌TH-2CGMCC No. 8695的營養培養基：葡萄糖20g/L，尿素3g/L，酵母 粉lg/L，磷酸氫二鉀3g/L，氯化鈉5g/L，pH值為7. 0-7. 5。
[0011] 枯草芽孢桿菌TH-2CGMCC No. 8695發酵條件：接種量8%，接種齡12h，初始ρΗ7· 5， 溫度37°C，攪拌速度200rpm，pH = 7,體積15m3,通氣量：2L/min。
[0012] 枯草芽孢桿菌TH-2CGMCC No. 8695在常溫常壓、上述營養培養基和發酵條件下產 量最高達到2. 4g/L。
[0013] 枯草芽孢桿菌TH-2CGMCC No. 8695發酵液的性能評價參數：耐溫性、耐鹽性、乳化 性能、表面張力、物理模擬實驗提高採收率值。
[0014] 枯草芽孢桿菌TH-2CGMCC No. 8695發酵生產的脂肽類表面活性劑的性能參數評價 方法：
[0015] (1)耐溫性能測定
[0016] 取已經配製好的不同濃度表面活性劑溶液，在恆溫器中加熱到150°C維持兩個小 時後，60°C下測其表界面張力。
[0017] ⑵耐鹽性能測定
[0018] 分別用不同濃度的NaCl溶液配製生物表活劑，配製後觀察是否有渾濁和沉澱產 生。
[0019] ⑶乳化性能測定
[0020] 以石蠟做模型油相，配製不同濃度的生物表面活性劑溶液，分別將25mL的生物表 面活性劑溶液與25mL油相加入到50mL的比色管中，然後在震蕩器上充分混合3min後，在 60°C下靜止，記錄乳化情況。
[0021] (4)表面張力測定
[0022] 用蒸餾水將液體樣品配製成質量分數為1 %的溶液，固體樣品配製成質量分數為 0. 3%的溶液，按GB/T5549的規定用掛片法測定。
[0023] (5)物理模擬驅油評價
[0024] ①填裝模擬巖心；
[0025] ②抽真空、飽和地層水，測定巖心孔隙度；
[0026] ③飽和原油，巖心老化7天；
[0027] ④一次水驅，水驅至採出水含水98%以上，計算一次水驅採收率；
[0028] ⑤注入該菌發酵生產的生物表面活性劑產品0. 2PV?0. 3PV ;
[0029] ⑥二次水驅，水驅至含水100%以上，計算該菌發酵產物提高採收率值。
[0030] 枯草芽孢桿菌TH-2CGMCC No. 8695發酵生產的脂肽類表面活性劑性能：耐溫 150°C，耐鹽15X104mg/L，乳化指數大於80%，表面張力最低27mN/m，物理模擬實驗提高採 收率大於12%。
[0031] 枯草芽孢桿菌TH-2CGMCC No. 8695發酵生產的脂肽類表面活性劑的現場應用工 藝：一種是直接利用發酵液與油田注入水混合注入油藏中進行驅油；另一種是將發酵液中 的表面活性劑進行粗提，然後將粗提的生物表面活性劑產品注入到油藏中進行驅油。
[0032] 所述將發酵液中表面活性劑進行粗提的方法：在發酵液中加入鹽酸將pH值調到 2. 0,利用超濾膜過濾後收集沉澱物。
[0033] 所述的利用發酵液與油田注入水混合注入油藏中進行驅油，是將發酵液與注入 水按照體積比為1:800?1000比例混合後注入油藏，混合液注入總量為油藏孔隙體積的 20%?30%，注入速度為1501113/(1?2001113/(1。
[0034] 所述的將粗提生物表面活性劑產品注入到油藏中進行驅油，是將粗提的生物表面 活性劑產品與注入水按照體積比為1:5000?6000比例混合後注入油藏，混合液注入總量 為油藏孔隙體積的20%?30 (%，注入速度為15〇1113/(1?20〇1113/(1。
[0035] 本發明的優點和積極效果在於：
[0036] 本發明提供的CGMCC No. 8695菌在最適溫度37?50°C和pH值7. 0?7. 5條件 下，發酵產生脂肽類生物表面活性劑，產量最高2. 4g/L，耐溫150°C，耐鹽15 X 104mg/L，乳化 指數大於80 %，表面張力最低27mN/m，物理模擬實驗提高採收率大於12 %，該菌株發酵液 和發酵液的粗提產品應用於現場試驗，提高採收率分別大於5. 0%和8. 0%。 四、

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 附圖1為TH-2菌株的形態結構圖；
[0038] 附圖2為TH-2發酵生產的脂肽溶液表面張力測試結果；
[0039] 附圖3為TH-2發酵液對柴油的乳化性能測試結果；
[0040] 附圖4為TH-2產脂肽類生物表面活性劑的耐溫性能測試結果；
[0041] 附圖5為TH-2產脂肽類生物表面活性劑耐鹽性能測試結果。 五、

【具體實施方式】
[0042] 下面結合具體實施例對本發明進行詳細的說明。
[0043] 實施例1 :
[0044] 本發明提供的枯草芽孢桿菌TH-2的形態特徵和生理生化特徵
[0045] 參照《Bergey's Mannual ofSystematic Bacteriology》的實驗方法進行，檢測器 革蘭氏染色，菌體大小和形態，有無鞭毛和芽孢，生長溫度，以及觸酶、澱粉水解、明膠液化、 半乳糖、木糖、乳糖等生化特徵。
[0046] 研究結果表明，如圖1所示，該菌株為革蘭氏染色陽性、菌體呈短杆狀、周生鞭毛、 能運動、好氧、有芽孢生成，細胞大小3 μ mXO. 5 μ m，大多數菌體呈散狀。生長溫度20? 50°C，最適生長溫度30°C，生長pH範圍4?9, NaCl耐受性0?3%。接觸酶、澱粉水解酶、 明膠液化、麥芽糖、D-半乳糖、a -D-葡萄糖、檸檬酸、D-松三糖、蔗糖、D-海藻糖均表現為 陽性，D-阿拉伯醇、山梨醇、琥珀酸、L-亮氨酸、龍膽二糖等均表現為陰性。
[0047] 實施例2 :
[0048] 本發明提供的枯草芽孢桿菌ΤΗ-2培養發酵及發酵液性能評價
[0049] 發酵培養基：葡萄糖20g/L，尿素3g/L，酵母粉lg/L，磷酸氫二鉀3g/L，NaC15g/L。
[0050] 發酵條件：為接種量8%，接種齡12h，初始ρΗ7· 5,溫度30°C，攪拌速度：250rpm， pH = 7,體積15m3,通氣量：2L/min，培養24小時後評價。
[0051] 發酵液的性能參數評價方法：
[0052] (1)耐溫性能測定
[0053] 取已經配製好的不同濃度表面活性劑溶液，在恆溫器中加熱到150°C維持兩個小 時後，60°C下測其表界面張力。
[0054] (2)耐鹽性能測定
[0055] 分別用不同濃度的NaCl溶液配製生物表活劑，配製後觀察是否有渾濁和沉澱產 生。
[0056] (3)乳化性能測定
[0057] 以石蠟做模型油相，配製不同濃度的生物表面活性劑溶液，分別將25mL的生物表 面活性劑溶液與25mL柴油加入到50mL的比色管中，然後在震蕩器上充分混合3min後，在 60°C下靜止，記錄乳化情況。
[0058] (4)表面張力測定
[0059] 用蒸餾水將液體樣品配製成質量分數為1 %的溶液，固體樣品配製成質量分數為 0. 3%的溶液，按GB/T5549的規定用掛片法測定。
[0060] (5)物理模擬驅油評價
[0061] ①填裝模擬巖心；
[0062] ②抽真空、飽和地層水，測定巖心孔隙度；
[0063] ③飽和原油，巖心老化7天；
[0064] ④一次水驅，水驅至採出水含水98%以上，計算一次水驅採收率；
[0065] ⑤注入該菌發酵生產的生物表面活性劑產品0. 2PV?0. 3PV ;
[0066] ⑥二次水驅，水驅至含水100%以上，計算該菌發酵產物提高採收率值。
[0067] 實驗結果表明（見附圖2?圖5)，該菌種發酵產生脂肽產量最高達到2. 4g/L，表 面張力為25mN/m，最高耐溫150°C，耐鹽15. OX 104mg/L，乳化指數92. 5%，物理模擬實驗 提高採收率值見表1。
[0068] 表I TH-2菌株代謝產物物理模擬提高原油採收率性能評價結果
[0069]

【權利要求】
1. 一株產耐高溫高鹽脂肽的枯草芽孢桿菌TH-2,已於2014年1月9日保藏於"中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"，命名為Bacillus subtilis. TH-2,其保藏編號 為 CGMMCC No. 8695。
2. 根據權利要求1所述的產耐高溫高鹽脂肽的枯草芽孢桿菌TH-2,其特徵在於，所述 菌株形態學特性為好氧固體培養基下培養1?2天出現大小為0. 5mm?1. 0mm乳白色菌落， 細胞形態為短杆狀，大小2?5 μ mXO. 5?1. 0 μ m ;生理生化特性為好氧，生長溫度37°C? 50°C，生長pH值範圍4?9，NaCl的耐受性0%?3% ;其營養培養基為葡萄糖20g/L，尿素 3g/L，酵母粉lg/L，磷酸氫二鉀3g/L，氯化鈉 5g/L，pH值為7. 0?7. 5 ;其發酵條件為接種 量8%，接種齡12h，初始ρΗ7· 5,溫度37°C，攪拌速度200rpm，pH = 7,體積15m3,通氣量：2L/ min〇
3. 根據權利要求2所述的產耐高溫高鹽脂肽的枯草芽孢桿菌TH-2,其特徵在於，所述 菌株生長pH值範圍為7?7. 5。
4. 根據權利要求1所述的產耐高溫高鹽脂肽的枯草芽孢桿菌TH-2,其特徵在於，所述 菌株發酵液性能為耐溫150°C，耐鹽15X 104mg/L，表面張力最低27mN/m。
5. 根據權利要求1?4中任一項權利要求所述產耐高溫高鹽脂肽枯草芽孢桿菌TH-2 在微生物採油中的應用，其特徵在於，所述的應用工藝包括以下兩種：（1)直接利用發酵液 與油田注入水混合注入油藏中進行驅油；（2)將發酵液中的表面活性劑進行粗提，然後將 粗提的生物表面活性劑產品注入到油藏中進行驅油。
6. 根據權利要求5所述產耐高溫高鹽脂肽的枯草芽孢桿菌TH-2在微生物採油中的 應用，其特徵在於：所述將發酵液中表面活性劑進行粗提，其方法是在發酵液中加入鹽酸將 pH值調到2. 0,利用超濾膜過濾後收集沉澱物。
7. 根據權利要求5所述產耐高溫高鹽脂肽的枯草芽孢桿菌TH-2在微生物採油中的應 用，其特徵在於，所述的直接利用發酵液與油田注入水混合注入油藏中進行驅油，是將發酵 液與注入水按照體積比為1:800?1000比例混合後注入油藏，混合液注入總量為油藏孔隙 體積的20%?30%，注入速度為150111 3/(1?2001113/(1。
8. 根據權利要求5所述產耐高溫高鹽脂肽的枯草芽孢桿菌TH-2在微生物採油中的應 用，其特徵在於，所述的將發酵液中生物表面活性劑粗提注入到油藏中進行驅油，是將粗提 的生物表面活性劑產品與注入水按照體積比為1:5000?6000比例混合後注入油藏，混合 液注入總量為油藏孔隙體積的20%?30%，注入速度為150111 3/(1?2001113/(1。
【文檔編號】C09K8/584GK104263681SQ201410455701
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月9日 優先權日:2014年9月9日
【發明者】林軍章, 宋欣, 王靜, 高光軍, 譚曉明, 馮雲, 曹功澤, 張守獻, 宋永亭, 汪衛東, 曹嫣濱 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司勝利油田分公司採油工藝研究院