一種固定化漆酶及其製備方法和應用的製作方法

2023-04-24 03:13:26

專利名稱：一種固定化漆酶及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及酶的固定化技術領域，具體是涉及一種用螯合樹脂固定化漆酶及其制 備方法和在汙水處理方面的應用。
背景技術：
漆酶(Laccases)是一種結合多個銅離子的蛋白質，屬於藍色多銅氧化酶家族，廣 泛存在於植物、真菌甚至昆蟲體內。漆酶可存活於空氣中，能夠催化包括酚及其衍生物、芳 胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、留體激素和生物色素、金屬有機化合物、非酚類底物等一 系列底物的氧化反應，反應後唯一的產物就是水，是一種綠色，環保，作用條件溫和的生物 催化劑，在生物造紙、食品生產、環境汙染治理、有機合成、生物及免疫檢測等方面具有很強 的應用潛力。因此，國內外對漆酶的研究已在生物、化學、物理、醫學等多領域，分子、細胞、 生物組織等多水平全面展開。漆酶蛋白一般由500-550個胺基酸構成，含19種胺基酸，不同來源的漆酶其氨基 酸序列相似性並不高，最大的共性是含有4個銅離子的活性結構中心，和銅原子連接的cys 和His及其周圍的胺基酸殘基是保守的，這些胺基酸都分布在含有兩對His的N末端區域， 或是分布於C末端的Cys和其餘結合銅離子的His之間。研究表明，目前提高漆酶酶活效 果最好的金屬離子主要是銅離子。固定化酶技術，就是將生物酶通過化學或物理的處理方法固定在固體載體上，使 原來水溶性的酶與固態的水不溶載體相結合，用於溶液中的酶促反應，反應完成後通過簡 單過濾即可與反應體系分離，並可以多次重複利用，降低生產成本。20世紀60年代後，固定 化酶技術的研究得到了蓬勃的發展，到目前為止，已研究開發了多種固定化方法，包括吸附 法、鍵合法、交聯法和包埋法，各自優缺點如表1所示。表1酶的幾種不同固載方法的比較 固定化漆酶技術以鍵合法和交聯法研究最為廣泛，為漆酶的廣泛應用提供了重要 的理論依據，但是現有的漆酶固定化方法和載體普遍存在著固定化效率低、加工工藝複雜、 生產成本高、性質不穩定等缺陷，很難工業生產並實際應用。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種利用螯合樹脂固定化漆酶的方
法及產品。本發明的進一步目的在於提供上述固定化漆酶在汙水處理方面的應用。本發明所提供的固定化漆酶是以螯合樹脂為載體，將漆酶通過吸附、螯合作用固 定在該載體上。所述的螯合樹脂，其結構中鍵合有含羧基的活性功能基團。其原理如圖1 所示，利用螯合樹脂上的羧基基團與漆酶蛋白中的胺基之間的靜電作用，將漆酶蛋白固定 到樹脂上後，漆酶蛋白中的4個銅原子會進一步與羧基基團配位螯合，從而使漆酶更加穩 定的固定在螯合樹脂上。其中，所述的螯合樹脂，其結構中鍵合有含羧基的活性功能基團，可以為市售商品 也可以通過常規方法修飾得到，優選為亞氨基羧酸型螯合樹脂和三元含羧基氯醋樹脂。本 發明所提供的固定化漆酶的製備方法如下(1)將螯合樹脂在乙醇中浸泡3_5h，濾去乙醇後，真空乾燥；(2)將乾燥後的樹脂放入含漆酶的磷酸緩衝液中(pH = 8. 0)，3_5°C下震蕩吸附 6-12h ；其中大約每Ig樹脂需要200U-500U的漆酶；(3)用pH = 8. 0的磷酸緩衝溶液洗滌，並檢測洗滌液，直到洗滌液中沒有蛋白檢
出ο本發明所提供的固定化漆酶可以應用於含酚類汙染物的汙水處理，例如造紙廢水 和工業染料廢水，實驗表明，本發明所提供的固定化漆酶2h內對2，4，6-三氯酚的去除率在 98%以上。本發明的優點和有益效果在於(1)本發明提供的固定化漆酶，加工工藝簡單，成 本低廉；(2)本發明提供的固定化方法，漆酶的吸附率高，可以達到90%以上；(3)本發明 提供的固定化漆酶，活性損失小，催化效率很高，性質穩定，可重複使用；(4)本發明通過靜 電和螯合雙重作用吸附固定漆酶，比傳統的離子交換吸附法吸附更加牢固，受溫度和PH影 響小；(5)本發明提供的固定化漆酶，一旦漆酶的活性降低後還可以再生，避免了載體的浪 費。


圖1為金屬螯合樹脂固定化漆酶原理示意圖；圖2為固定化漆酶的操作穩定性試驗結果。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施 例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1亞氨基羧酸型螯合樹脂固定化漆酶的製備(1)將IOg市售亞氨基羧酸型螯合樹脂(型號LSC-100)在500ml乙醇中浸泡4h， 濾去乙醇後，真空乾燥4h;(2)將乾燥後的樹脂放入500ml含3000U漆酶的磷酸緩衝液中(pH = 8. 0)，4°C下震蕩吸附6-12h ；(3)用pH = 8. 0的磷酸緩衝溶液洗滌，並檢測洗滌液，直到洗滌液中沒有蛋白檢
出ο(4)利用考馬斯亮藍染色法(Bradford法)分別測定固定前加入的漆酶量Ml和 固定後洗出液中剩餘的漆酶量M2，計算出漆酶的固定化率漆酶的固定化率=[(M1-M2)/ Ml] X 100%。漆酶的固定化率為92%。實施例2三元含羧基氯醋樹脂固定化漆酶的製備(1)將IOg市售三元含羧基氯醋樹脂(型號C42)在500ml乙醇中浸泡4h，濾去乙 醇後，真空乾燥4h;(2)將乾燥後的樹脂放入500ml含5000U漆酶的磷酸緩衝液中(pH = 8. 0)，4°C下 震蕩吸附6-12h;(3)用pH = 8. 0的磷酸緩衝溶液洗滌，並檢測洗滌液，直到洗滌液中沒有蛋白檢
出ο(4)利用考馬斯亮藍染色法(Bradford法)分別測定固定前加入的漆酶量Ml和 固定後洗出液中剩餘的漆酶量M2，計算出漆酶的固定化率漆酶的固定化率=[(M1-M2)/ Ml] X 100%。漆酶的固定化率為86%。實施例3固定化漆酶的熱穩定性分別將實施例1中的固定化漆酶和游離漆酶置於70°C水浴中保溫，定時取樣檢測 其氧化愈創木酚的活性，結果表明游離酶在70°C水浴中保溫Ih後，酶活力明顯下降，4h後 酶活損失達到99%以上。而固定化漆酶在相同條件下保溫4h酶活僅損失19%，8h時仍保 留酶活56. 5%，顯示酶經固定化後其熱穩定性得到明顯提高。實施例2的固定化漆酶與此 類似。實施例4固定化漆酶的pH穩定性取適量的實施例1中的固定化漆酶，分別懸浮於pH值不同的磷酸緩衝液中，25°C 保溫，每隔一段時間取出測定酶活性。結果表明，在PH 4.0 9.0範圍內，固定化漆酶有較 好的穩定性；當緩衝液PH低於3. 0時，固定化漆酶活性減少較快，酶的穩定性較差。實施例 2的固定化漆酶與此類似。實施例5固定化漆酶處理氯酚類廢水的效果將5g實施例1中的固定化漆酶裝入循環固定化酶反應裝置中，在25 °C條件下半連 續處理酚類汙染物，氧化2，6- 二氯酚和2，4，6-三氯酚，當反應循環進行Ih後，有70 %的 2,4,6-三氯酚和47 · 9%的2，6- 二氯酚被氧化；2h後，98%的2，4，6-三氯酚和70%的2， 6- 二氯酚被去除。實施例2的固定化漆酶與此類似。實施例6固定化漆酶的操作穩定性將5g實施例1中的固定化漆酶裝入循環固定化酶反應裝置中，在25 °C條件下半連 續處理酚類汙染物，氧化2，6-二氯酚和2，4，6-三氯酚，當反應循環進行12批次後，固定化 漆酶酶活仍保持60%以上，結果如圖2所示。實施例2的固定化漆酶與此類似。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾 也應視為本發明的保護範圍。
權利要求
一種固定化漆酶，其特徵在於，其是以螯合樹脂為載體，將漆酶通過吸附、螯合作用固定在該載體上，所述螯合樹脂的結構中鍵合有含羧基的活性功能基團。
2.如權利要求1所述的固定化漆酶，其特徵在於，所述螯合樹脂為亞氨基羧酸型螯合 樹脂和三元含羧基氯醋樹脂。
3. 一種固定化漆酶的製備方法，其特徵在於，將經過乙醇處理後的螯合樹脂經乾燥後 放入含漆酶的緩衝液中，震蕩吸附即得固定化漆酶，其中所述螯合樹脂的結構中鍵合有含 羧基的活性功能基團。
4.如權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)將螯合樹脂在乙醇中浸泡3-5h，濾去乙醇後，真空乾燥；(2)將乾燥後的樹脂放入含漆酶的pH8.0磷酸緩衝液中，3-5°C下震蕩吸附6-12h ；(3)用磷酸緩衝溶液洗滌，直到洗滌液中沒有蛋白被檢出。
5.權利要求1或2所述的固定化漆酶在含酚類汙染物的汙水處理中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述含酚類汙染物的汙水為造紙廢水或工 業染料廢水。
全文摘要
本發明公開了一種固定化漆酶，其是以螯合樹脂為載體，將漆酶通過吸附、螯合作用固定在該載體上，所述螯合樹脂的結構中鍵合有含羧基的活性功能基團。本發明的固定化漆酶能夠應用於含酚類汙染物的汙水處理中，具有加工工藝簡單，成本低廉，漆酶吸附率高，漆酶活性損失小，性質穩定等特點。
文檔編號C02F103/28GK101914515SQ20101022818
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月8日 優先權日2010年7月8日
發明者劉迎春, 高源 申請人:北京歐凱納斯科技有限公司