黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標記及其專用引物和應用的製作方法

2023-06-02 06:51:31

黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標記及其專用引物和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標記及其專用引物和應用。該分子標記，是用以下引物對自黃瓜總DNA中擴增出來的核苷酸序列之一：序列表中SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2、序列表中SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4。上述分子標記可鑑定目的基因黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的存在，實現對抗病植株的間接選擇，由於不受其他基因效應和環境因素的影響，可用於早代選擇，縮短育種年限，提高育種效率。
【專利說明】黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標記及其專用引物和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程【技術領域】的分子標記，特別涉及與黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4連鎖的分子標記及其在黃瓜種質資源選擇中的應用。
【背景技術】
[0002]黃瓜(Cucumis Sativus.L)在世界上廣泛栽培，中國是世界上黃瓜栽培面積最大、
總產量最高的國家。
[0003]黃瓜枯萎病(Fusarium Wilt)，又名萎蔫病、蔓割病、死秧病，由尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum Owen.)侵染所致，是一種由土壤傳染，從根或根頸部侵入，在維管束內寄生的系統性病害(導管型枯萎病)，是黃瓜生產上較難防治的三大病害之一，是目前世界各地黃瓜，特別是溫室和其他保護地黃瓜的主要土傳病害，一般年份可使黃瓜產量損失25%-35%，嚴重發病時可使黃瓜絕產。枯萎病採用化學防治效果不理想，不僅使生產投入增加且會造成環境安全隱患，倒茬嫁接雖常用於防控但增添技術困難和勞動成本。因此選育抗病品種是解決枯萎病危害的最佳途徑。
[0004]黃瓜枯萎病抗病基因影響黃瓜對枯萎病的抗性，它的研究將會推動抗病育種進程。用與目的性狀緊密連鎖的分子標記進行標記輔助選擇在黃瓜遺傳育種中十分有效，分子標記是在DNA水平上對目標性狀進行選擇，具有高效、快速、不受環境條件限制等優點，可在苗期進行選擇，加快育種進程。因此，開發用於輔助鑑定黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標記十分必要。

【發明內容】

[0005]針對現有技術的缺陷，本發明的`目的在於提供一種黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標記及其專用引物和應用。
[0006]為了實現上述目的，本發明採用了以下技術方案:
[0007]—種黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標記，是用以下引物自黃瓜總DNA中擴增出來的核苷酸序列之一:序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2、序列表中SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4。
[0008]獲得上述黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標記的引物如下:1)獲得黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標記FWSNPl的引物為序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2 ;2)獲得黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標記FWSNP2的引物為序列表中SEQ ID NO: 3和SEQID N0:4。
[0009]利用上述引物對，通過常規PCR法可得到上述分子標記。
[0010]本發明涉及的與黃瓜抗枯萎病共分離的dCAPs標記FWSNP1，是利用抗/感遺傳群體(母本:WF2757，抗枯萎病；父本:津研二號，感枯萎病)進行精細定位和克隆獲得的。通過利用90個RIL-F8株系，130株的F2:3群體對枯萎病抗病基因Foc_4進行初步定位，然後利用2000株的F2群體對Foc-4進行精細定位到25kb的區間內。該區間內含2個基因，分別是TIR NB-ARC抗病基因和bHLH96-like轉錄因子，其中TIR NB-ARC基因經過驗證分析，被證實為枯萎病抗病基因Foc-4的重要候選基因。通過對比研究Foc-4基因在抗/感黃瓜材料中的序列差異，發現一個 SNP 位點，依據 http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html,在線設計軟體，開發設計了與抗/感枯萎病緊密連鎖的dCAPs分子標記FWSNP1。同時利用FffSNPl標記分析2000多株遺傳群體材料，結合田間枯萎病接種鑑定研究，發現FWSNPl標記與抗感枯萎病緊密連鎖，達到共分離。
[0011]本發明涉及的另一個黃瓜抗枯萎病SNP2關鍵位點，其在抗病基因Foc-4中導致了胺基酸編碼的變化。該SNP位點是通過對不同遺傳背景的黃瓜枯萎病抗感材料進行基因組重測序獲得的,通過對多個黃瓜抗感材料進行重測序,利用BWA-Samtools (v0.1.12a,mpileup按照默認參數)軟體分析Foc_4基因在不同材料中的SNP位點，結合黃瓜基因組9930-V2和基因組注釋，發現Foc-4基因的915位存在單鹼基差異SNP2位點(由A到C)，導致了 Foc-4基因中編碼胺基酸的差異(從Ile到Leu)。並利用該SNP2位點設計標記，獲得FWSNP2分子標記，通過分析上述黃瓜材料的基因型，結合田間枯萎病接種鑑定材料抗感病表型，發現FWSNP2標記分析的基因型與抗感表型一致，證明FWSNP2可作為枯萎病緊密連鎖分子標記，篩選黃瓜材料。
[0012]上述分子標記或引物在選育抗黃瓜枯萎病品種中的應用。
[0013]在上述應用中，優選地，所述分子標記FWSNPl在選育抗黃瓜枯萎病品種中的應用的具體方法為:以待測黃瓜材料的基因組DNA作為模板，用序列表中SEQ ID NO:1和序列表中SEQ ID NO: 2所示的核苷酸組成的特異性引物進行PCR擴增，然後採用SalI內切酶對PCR產物酶切，如果得到164bp的酶切產物，則待測黃瓜為抗病材料；如果得到134bp的酶切產物，則待測黃瓜為感病材料；更優選地，所述待測黃瓜材料為WF2757、M21或者COUNTYFAIR Fl，或者以WF2757、M21和/或COUNTY FAIR Fl作為親本得到的子代；
[0014]在上述應用中，優選地，所述分子標記FWSNP2在選育抗黃瓜枯萎病品種中的應用的具體方法為:以待測黃瓜材料的基因組DNA作為模板，用序列表中SEQ ID NO: 3和序列表中SEQ ID N0:4所示的核苷酸組成的特異性引物進行PCR擴增，然後採用MaeII內切酶對PCR產物酶切，如果得到165bp的酶切產物，則待測黃瓜為抗病材料；如果得到135bp的酶切產物，則待測黃瓜為感病材料；更優選地，所述待測黃瓜材料為VICTORY或者DIHUANGGUA,或者以VICTORY和/或者DI HUANGGUA作為親本得到的子代。
[0015]本發明具有如下有益效果:
[0016]本發明的dCAPs標記FWSNPl和FWSNP2與黃瓜枯萎病抗病存在緊密連鎖關係(共分離)，可鑑定目的基因黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的存在，實現對抗病植株的間接選擇，由於不受其他基因效應和環境因素的影響，可用於早代選擇，縮短育種年限，提高育種效率，為進行黃瓜枯萎病抗病育種提供技術支持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1是黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4定位連鎖圖譜，其中左圖黃瓜枯萎病基因初定位不意圖，中圖為枯委病抗病基因精細定位不意圖，右圖為25kb區間範圍內基因分布情況及基因注釋；[0018]圖2是Foc-4基因FWSNPl分子標記在某一群體中酶切驗證結果示意圖；
[0019]圖3是Foc-4基因FWSNP2分子標記在某一群體中酶切驗證結果示意圖；
[0020]圖4是Foc-4基因FWSNPl分子標記在另一群體中的酶切鑑定結果示意圖；
[0021]圖5是Foc-4基因FWSNP2分子標記在另一群體中的酶切結果示意圖。
【具體實施方式】
[0022]下面通過具體實施例對本發明進行詳細說明，但本發明並不限於此。
[0023]實施例1黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的獲得
[0024]一、黃瓜枯萎病生理小種4的抗病基因Foc-4初步定位和精細定位
[0025]具體的定位方法包括以下步驟:
[0026]A、黃瓜枯萎病抗病基因定位研究親本及遺傳群體:
[0027]分別選擇WF2757 (父本)和津研二號(母本)為抗感親本，構建90個RIL-F8株系，130株的F2:3群體和超過2000株的F2大群體。其中，父本WF2757和母本津研二號購自北京市農作物種質資源庫。
[0028]B、黃瓜枯萎病抗病基因定位研究病情指數調查:
[0029]將親本及各群體的種子用紗布包裹，溫湯浸種，28°C恆溫催芽後播於50孔穴盤中，在空調溫室育苗，育苗基質為滅菌的珍珠巖或營養土。
[0030]供試菌種黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.cucumerinum Owen.)生理小種4號是根據黃仲生等的中國黃瓜枯萎病菌生理小種鑑定及防治文獻(中國黃瓜枯萎病菌生理小種鑑定及防治，華北農學報，1994，9 (4):81-86)中記載的方法分離獲得的。採用翁祖信等(黃瓜枯萎病抗病性鑑定方法研究一胚根接種法，中國蔬菜，1985年02期)的方法製備黃瓜枯萎病菌液，血球計數板測定孢子濃度。採用浸根接種法:當黃瓜幼苗子葉展平時，拔出幼苗，用水洗淨根部，在I X IO6~5 X IO6個孢子/mL的接種液中浸根，然後栽入裝有滅菌營養土的塑料營養缽(規格6.5cmX 6.5cm)中，在溫室中培養。白天維持在24~28°C，夜間在16~20°C。3次重複，每次重複30株。
[0031]按上述方法接種後7~IOd進行病情調查。病情分級標準為:0級:無症狀；1級:I片子葉黃化；2級:2片子葉黃化或萎蔫；3級:1片真葉輕度萎蔫；4級:1~2片真葉明顯萎蔫；5級:全株嚴重萎蔫或枯死。其中2以下為抗病，3以上為感病類型。
[0032]對親本及各群體的病情進行精確統計。
[0033]C、黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的初步定位:
[0034]利用 Cavagnaro 等(Genome-wide characterization of simple sequencerepeats in cucumber, BMC Genomics, 2010)發表的黃瓜高密度遺傳圖引物信息,結合90個RIL-F8株系和130株的F2:3群體病情指數的精確統計，對親本和RIL群體進行分子標記分析，編碼採集親本及RILs群體各單株基因型數據。母本基因型記為A，父本的基因型記為B，F1雜合基因型記為H，模糊或缺失數據記為U。用x2test對數據進行比例適合性檢驗分析，採用JoinMap4.0軟體(Staml993 ；Van 0oijen2001)構建連鎖圖譜(參見圖1)，設置軟體LOD閥值為4.0以及選取Kosambi公式(Kosambi 1944)，將黃瓜抗枯萎病基因初步定位在2號染色體的分子標記UW017820 和UW084909之間的160kb區間內(參見圖1)，根據Li等(RNA-Seq improves annotation of protein-coding genes in the cucumber genome, BMCgenomics, 2011)對黃瓜基因組的注釋並通過Softberry在線軟體進行預測,該區間存在一個由多個NBS-LRR抗病基因組成的NBS-LRR串聯抗病基因(NBS-LRR為抗病基因保守結構域)，難以預測和選擇候選基因，所以需要進一步擴大群體進行精細定位研究。
[0035]D、黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的精細定位:
[0036]經過構建超過2000株的F2大群體繼續對抗枯萎病基因進行精細定位，同時,本實驗室對所用抗感親本進行了基因組重測序，經過生物信息比對分析，在雙親間開發了 79560個Indel和108727個SNP分子標記，在初定位區間的160kb範圍內選擇設計了 14對Indel分子標記(參見表1)進行群體分析，經過驗證後利用這14對Indel標記對抗枯萎病基因進行了精細定位研究，其中引物的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，同樣利用JoinMap4.0軟體進行遺傳連鎖作圖分析，最終在2000株的F2大群體將抗枯萎病基因精細定位到分子標記UW017805和Indel2027634的25kb的範圍內，在精細定位區間內近2300株的試驗材料中存在I個交換單株。
[0037]採用上述14對Indel分子標記進行精細定位時的各PCR反應體系(10 μ L)如下:25ng 模板DNA，0.5μΜ上遊引物，0.5μΜ 下遊引物，0.2mM 的 dNTP mix ；0.5U Taq DNA 聚合酶，IXPCR Buffer (Fermentas) 2 μ L，ddH20 補足到 10 μ L。
[0038]PCR 反應程序為:階段 1:95 V 預變性 3min ;階段 2:94 V 30s, 60 V lmin，72°C lmin，退火溫度每個循環降1°C，共8個循環；階段3 -MV 30s, 53°C 30s, 72°C lmin,共32個循環；階段4:72 °C延伸5min ;階段5:4 °C保存；其中，PCR儀為購自Appl iedBiosystems 公司的 Veriti96well Thermal Cycler。
[0039]表1用於精細定位的14對Indel分子標記引物信息
[0040]
【權利要求】
1.一種黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標記，是用以下引物自黃瓜總DNA中擴增出來的核苷酸序列之一:序列表中SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2、序列表中SEQ ID N0:3和SEQID N0:4。
2.獲得權利要求1所述黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標記的引物如下:1)獲得黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標記FWSNPl的引物為序列表中SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2 ；2)獲得黃瓜枯萎病抗病基因Foc-4的分子標記FWSNP2的引物為序列表中SEQ IDNO:3 和 SEQ ID NO:4。
3.權利要求1所述分子標記或權利要求2所述引物在選育抗黃瓜枯萎病品種中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述分子標記FWSNPl在選育抗黃瓜枯萎病品種中的應用的具體方法為:以待測黃瓜材料的基因組DNA作為模板，用序列表中SEQID NO:1和序列表中SEQ ID NO: 2所示的核苷酸組成的特異性引物進行PCR擴增，然後採用SalI內切酶對PCR產物酶切，如果得到164bp的酶切產物，則待測黃瓜為抗病材料；如果得到134bp的酶切產物，則待測黃瓜為感病材料。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，所述待測黃瓜材料為WF2757、M21或者COUNTY FAIR F1，或者以WF2757、M21和/或COUNTY FAIR Fl作為親本得到的子代。
6.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述分子標記FWSNP2在選育抗黃瓜枯萎病品種中的應用的具體方法為:以待測黃瓜材料的基因組DNA作為模板，用序列表中SEQID N0:3和序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸組成的特異性引物進行PCR擴增，然後採用MaeII內切酶對PCR產 物酶切，如果得到165bp的酶切產物，則待測黃瓜為抗病材料；如果得到135bp的酶切產物，則待測黃瓜為感病材料。
7.根據權利要求6所 述的的應用，其特徵在於，所述待測黃瓜材料為VICTORY或者DIHUANGGUA,或者以VICTORY和/或者DI HUANGGUA作為親本得到的子代。
【文檔編號】C12Q1/68GK103882017SQ201410115373
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月25日 優先權日:2014年3月25日
【發明者】溫常龍, 毛愛軍, 董從娟, 張海英, 王永勤, 王永健, 於拴倉, 許勇 申請人:北京市農林科學院