免疫應答的調製的製作方法

2023-06-29 20:58:51 2

>說明二氧化矽[硅藻土]質量／片1-10g穩定劑說明氯化鈉和碳酸鎂／鈣施用方法間接施用藥物(例如DMF)可這樣進行在將貼片貼到皮膚上之後，用注射器將已知量的活性劑注入所述二氧化矽吸附物質中。通過應用該方法獲得如下優點1．從安瓿／容器到貼片上的受控施藥。2．可按患者生活型預定治療劑劑量。3．通過將所述藥劑變成濃度依賴性，在治療過程中治療時間和皮膚暴露的面積就保持恆定。4．可以有信心地施用貼片和藥劑而不會對患者過量用藥。5．貼片和藥劑都容易施用，並且患者在施藥後可以出院。6．貼片很穩定，具有無限的存放期，並且，除非另有規定，從安瓿施用的藥劑具有至少兩年的失效期。現在將參照如下實施例闡述本發明，但不是藉此將本發明的範圍限定於該闡述性的實施方案。實施例1通過應用免疫研究文獻中被很好地描述過並且為人所知的密度梯度分離法從健康志願者的全血分離人外周淋巴細胞。簡單地說，通過該方法，用磷酸鹽緩衝鹽水或細胞培養基(例如RPMI1640)1∶2稀釋外周全血。然後，密度梯度(例如Histopaque1077[SigmaCat#1077])就在稀釋後的外周血液下方分層，務必小心使之形成明顯的界面。然後在600g下離心該密度梯度20～25分鐘。離心後容易看到一層含大部分淋巴細胞的清亮的暗黃色表層。再將該層分離並進一步處理，即將該暗黃色表層置於另一支試管中，用PBS或細胞培養基將細胞洗滌3次。每個洗滌步驟後都在400g下將細胞離心9分鐘。第三次洗滌後，從粒狀沉澱收集淋巴細胞。計數該細胞並稀釋到所需的細胞濃度。應用完全細胞培養基作為稀釋劑配製種種DMF濃度。配製了如下濃度1％、0．1％、0．05％、0．01％和0．001％。應用完全細胞培養基將分離的淋巴細胞稀釋到所要求的濃度。在上述步驟中應用的完全細胞培養基含RPMI1640(含HEPES)20～25mM，L-穀氨醯胺1mM，二巰基乙醇2X10-5mM和10％熱滅活的胎牛血清。將配製的淋巴細胞以每孔150，000個細胞的濃度置於96孔細胞培養板中。往每個試驗孔添加濃度為1～10μg／200μl的PHA[植物凝集素]。同時，往每個試驗孔添加預定濃度的DMF，在37℃下，在5％CO2、95％O2氣氛中將所述培養孔保溫1～4天。以10％體積體積往每個培養孔添加以商標「AlamarBlue」出售的氧化還原指示劑。將培養物與AlamarBlue一起保溫18小時，然後以630nm為參比測定570nm處的吸光度。可將結果歸納如下培養物(其中，得自健康志願者的外周淋巴細胞暴露於PHA和濃度為％的DMF達24小時)還原了處於正常PHA生長孔中的培養物所還原AlamarBlue量的102％。但是，添加了濃度只有0．05％的DMF的培養物只還原了含PHA刺激的淋巴細胞的培養物所還原AlamarBlue量的52％。這表明了培養物孔中代謝活動的顯著抑制，它與該特定孔中細胞增殖的水平密切相關。當比較未刺激的淋巴細胞與暴露於低濃度DMF的未刺激的淋巴細胞還原AlamarBlue所指示的代謝活動時，觀測到暴露於0．05％DMF濃度的淋巴細胞還原的AlamarBlue減少了40％。[見圖1和2，這兩幅圖表示了一些重複實驗的代表性結果]。實施例2為了闡明DMF在引起對淋巴細胞代謝活動的抑制方面假定的作用機制，進行了另一系列的實驗。在這些實驗中，應用實施例1中描述的方法分離了健康志願者的淋巴細胞。在分離了淋巴細胞之後，將該淋巴細胞暴露於不同濃度的DMF達不同長度的保溫時間。應用的DMF濃度是0．1％、0．01％和0．001％，保溫時間是5、15、30、75、120和180分鐘。應用可商購的酪氨酸激酶分析試劑盒(可得自BoehringerMannheim[分類號為1534505])測定了酪氨酸激酶活性。結果如圖3和4中所示。暴露於濃度為0．01％的DMF3小時後，受試驗淋巴細胞的酪氨酸激酶活性被抑制了71％。應指出的是，在該圖中，吸光度讀數越低，酪氨酸激酶活性抑制的程度就越高。該圖的大體形狀保持相同，這與顯色反應的顯色時間無關。該結果支持了作為本發明基礎的假設，即淋巴細胞與之接觸達一定時間的、一定濃度的DMF，起阻滯酪氨酸激酶活性的作用。有這種可能性，在受試驗的淋巴細胞中觀察到的酪氨酸激酶活性的降低可能是由於刺激某些酪氨酸磷酸酶的緣故。給出的圖是獲得的很多圖的典型實例。實施例3進一步用實驗證實了DMF及其兩種代謝物的PTK抑制活性，即通過比較它與可商購的PTK抑制劑Piceattanol(由BoehringerMannheim以#1534505銷售的)對兩種細胞系[即HELA(一種子宮頸癌細胞系)和HEP3B(一種肝癌細胞系)]的作用。獲得了如下結果所述抑制劑是以10％DMSO溶液應用的。試驗是在下列條件下進行的，得到如下所示的結果Slank0，043FunctCntrl內源性磷酸酶20．3％內源性磷酸化0．14活性平均抑制HELA抑制劑0，076[Pilleattanol+10％DMSO]66％75％29，5％清潔細胞0，115100％0％2％代謝物Ⅰ0，09986％95％9，5％0，2％謝物Ⅱ0，07464％80％28，5％2％代謝物Ⅱ0，05548％55％48，5％0，2％DMF0，07363％83％27％2％DMF0，04237％47％58％HEP3B抑制劑0，05560％60％40％[Pilleattanol+10％DMSO]66％75％29，5％清潔細胞0，091100％0％2％代謝物Ⅰ0，09099％81％10％0，2％代謝物Ⅱ0，03640％32％64％2％代謝物Ⅱ0，09560％51％44，5％0，2％DMF0，08088％66％33，3％2％DMF0，04044％34％61％IC501，7-17μM被確定IC501，7-17μM被確定符號代謝物Ⅰ-N-甲基甲醯胺代謝物Ⅱ-N-甲胩DMF-二甲基甲醯胺權利要求1．一種影響動物中免疫應答的方法，該方法包括如下步驟給這類動物施用無毒、免疫調製有效量的化合物，該化合物選自化學通式(Ⅰ)的化合物R1-CO-NR2R3(Ⅰ)其中，R1選自H和低級[即C1～C3]烷基和C2～C3鏈烯基；R2和R3相同或不同，並且各自選自H、低級[即C1～C3]烷基和C2-C3鏈烯基，它們任選可被滷化或羥基化，或者它們可以相互連接構成-(CH2)n-基，其中n是2～5的任意數，或-(CH2)2-O-(CH2)2基，及其代謝物和前體藥物。2．權利要求1的方法，其中，受該方法影響的免疫應答是構成身體免疫系統的一部分的免疫細胞的免疫應答。3．權利要求2的方法，其中，所述細胞選自T淋巴細胞和B淋巴細胞。4．權利要求1的方法，進行該方法是為了減少體內免疫細胞產物的表達和分泌。5．一種治療患有疾病的動物的方法，該疾病與該動物中不適當的免疫應答有關，所述方法包括如下步驟給這樣的動物施用無毒、治療上有效量的化合物，該化合物選自化學通式(Ⅰ)的化合物R1-CO-NR2R3(Ⅰ)其中，R1選自H和低級[即C1～C3]烷基和C2～C3鏈烯基；R2和R3相同或不同，並且各自選自H、低級[即C1～C3]烷基和C2～C3鏈烯基，它們任選可被滷化或羥基化，或者它們可以相互連接構成-(CH2)n-基，其中n是2～5的任意數，或-(CH2)2-O-(CH2)2基，及其代謝物和前體藥物。6．一類化合物在製備用於治療患有疾病的動物的方法中的藥劑方面的應用，該疾病與該動物中不適當的免疫應答有關，所述化合物選自化學通式(Ⅰ)的化合物R1-CO-NR2R3(Ⅰ)其中，R1選自H和低級[即C1～C3]烷基和C2～C3鏈烯基；R2和R3相同或不同，並且各自選自H、低級[即C1～C3]烷基和C2～C3鏈烯基，它們任選可被滷化或羥基化，或者它們可以相互連接構成-(CH2)n-基，其中n是2～5的任意數，或-(CH2)2-O-(CH2)2基，及其代謝物和前體藥物。7．一種用於治療患有疾病的動物的藥物組合物，該疾病與該動物中不適當的免疫應答有關，所述組合物包含一種化合物，該化合物選自化學通式(Ⅰ)的化合物R1-CO-NR2R3(Ⅰ)其中，R1選自H和低級[即C1～C3]烷基和C2～C3鏈烯基；R2和R3相同或不同，並且各自選自H、低級[即C1～C3]烷基和C2～C3鏈烯基，它們任選可被滷化或羥基化，或者它們可以相互連接構成-(CH2)n-基，其中n是2～5的任意數，或-(CH2)2-O-(CH2)2基，及其代謝物和前體藥物，呈藥物上可接受的劑型。8．權利要求5的方法、權利要求6的應用或權利要求7的組合物，其中，所述疾病選自下組系統性紅斑狼瘡[SLE]硬皮病[全身性硬化症]血管炎症候群[包括華格納氏血栓形成和各種形式的巨細胞關節炎]皮肌炎哮喘成人呼吸窘迫症候群[ARDS]系統性炎症反應症候群[SIRS]炎性腸病慢性肝炎類風溼性關節炎風溼熱重症肌無力多發性硬化症牛皮癬溼疹多發性骨髓瘤賴特爾症候群腎小球腎炎多肌痛風溼病關節強硬性脊椎炎結節性多動脈炎過敏性鼻炎糖尿病眼神經炎急性Transversmielitis頭損傷脊髓損傷蛛網膜下出血後的血管痙攣。9．權利要求1～8任一項的方法、應用或組合物，其中，所述化合物是二甲基甲醯胺。10．權利要求9的方法，其中，給待治療的患者以一定的速率和一定量的施用二甲基甲醯胺，所述量和速率足以保持血漿DMF含量為0．001％～0．1％。11．權利要求9的方法、應用或組合物或權利要求10的方法，其中，所述藥劑被經皮給藥或者適合經皮給藥。12．權利要求11的方法、應用或組合物，其中，DMF藉助於大致如本文所述的經皮貼片施用或者適合這樣施用。全文摘要一種根據動物中對外界免疫刺激物或內源性免疫刺激物的免疫應答而影響或調製免疫細胞產物的刺激或抑制的方法,該方法包括如下步驟:給這類動物施用無毒、免疫調製有效量的化合物,該化合物選自化學通式(Ⅰ)R文檔編號A61P43/00GK1279612SQ98810397公開日2001年1月10日申請日期1998年9月16日優先權日1997年9月16日發明者C·J·蘭多爾,G·J·杜普瑞茲,V·R·施拉克,D·C·阿特費爾德,J·B·范丹伯加爾丹申請人:弗朗戈德控股有限公司