一種表達人α1‑抗胰蛋白酶的重組細胞株及其應用的製作方法
2023-05-29 17:37:41 1
本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及一種表達人α1-抗胰蛋白酶的重組細胞株及其應用。
背景技術：
人α1-抗胰蛋白酶缺乏症(aatd)是一種世界範圍的遺傳疾病，為單基因突變導致的常染色體共顯性遺傳，主要表現為肺氣腫、肝硬化、肝癌，少數體現為皮膚疾病脂膜炎等。aatd患者的治療需要依賴周期性靜脈注射人α1-抗胰蛋白酶製劑。
目前，臨床使用的人α1-抗胰蛋白酶製劑主要由人血漿純化獲得，這限制了其大批量生產，導致了人α1-抗胰蛋白酶製劑供不應求，價格昂貴，僅有部分患者有條件使用。除此之外，由於診斷技術的限制，多數的aatd患者至今未得到有效診斷，所以隨著診斷技術的進步，人α1-抗胰蛋白酶製劑的需求勢必將進一步增加。然而，人血漿資源供應有限，制約著血漿純化來源的人α1-抗胰蛋白酶製劑的供應，亟需開發重組人α1-抗胰蛋白酶製品。目前，世界上尚無藥用的重組人α1-抗胰蛋白酶製品產生。
技術實現要素：
本發明為了克服現有技術的上述不足，提供一種表達人α1-抗胰蛋白酶的重組細胞株。
本發明的另一個目的是提供一種表達人α1-抗胰蛋白酶的重組細胞株的應用。
為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案予以實現的：
一種表達人α1-抗胰蛋白酶的重組體細胞株的構建方法，包括如下步驟：
(1)獲得含人α1-抗胰蛋白酶基因序列、篩選標記基因序列、aavs1位點左、右同源臂序列的表達質粒，表達質粒中所述人α1-抗胰蛋白酶基因序列、篩選標記基因序列在所述aavs1位點的左、右同源臂之間；在表達質粒中篩選標記基因的兩側分別插入一個loxp序列，且這兩個loxp序列的方向一致，得到改造的表達人α1-抗胰蛋白酶的重組質粒；
(2)將步驟(1)改造的表達人α1-抗胰蛋白酶的重組質粒和靶向aavs1位點的crispr/cas9質粒共轉染人的體細胞，篩選獲得定點整合的體細胞；
(3)以表達cre酶的質粒轉染步驟(2)獲得的定點整合的體細胞，通過cre/loxp系統切除篩選標記，篩選獲得切除了篩選標記且穩定表達重組α1-抗胰蛋白酶的體細胞株。
本發明的細胞株是通過crispr/cas9基因編輯技術結合同源重組實現的。其中crispr/cas9的靶序列在人的基因組aavs1位點，靶序列為ggggccactagggacaggat。當crispr/cas9質粒和改造後的表達載體共轉染體細胞後，crispr/cas9系統在靶位點處剪切dna，形成雙鏈缺口。在存在含有同源臂的目的基因載體的情況下，雙鏈缺口以其為模板，進行同源重組修復，實現目的基因在靶點處的定點插入。
在本發明中，人基因組的aavs1位點位於人19號染色體的ppp1r12c基因的內含子中；所述人α1-抗胰蛋白酶具有如seqidno:1所示的胺基酸序列，人α1-抗胰蛋白酶的基因具有如seqidno:2所示的核苷酸序列。
步驟(1)所述含人α1-抗胰蛋白酶基因序列、篩選標記基因序列、aavs1位點左、右同源臂序列的表達質粒，可以通過克隆技術進行構建，也可以直接採用商業化的產品質粒。優選地，步驟(1)所述含人α1-抗胰蛋白酶基因序列、篩選標記基因序列、aavs1位點左、右同源臂序列的表達質粒為genome-talertm貨號為dc-don-sh01的aavs1供體克隆載體。
優選地，所述loxp序列如seqidno:4所示。
aavs1位點在所有的人細胞中存在，所以所有類型的人細胞都可以通過該方法進行基因編輯，只是蛋白表達量可能有所不同。優選地，選擇已經商業化生產的人的體細胞作為受體細胞，更便於工業生產，最優選地，所述人的體細胞為hek293細胞或per.c6細胞。尤其是hek293細胞，其表達目的蛋白的量特別好，另外，該細胞株表達的人α1-抗胰蛋白酶的結構和功能更類似於天然的α1-抗胰蛋白酶，更有利於人α1-抗胰蛋白酶製劑的推廣和應用。
優選地，本發明提供的重組細胞株的製備方法中，步驟(1)中的所述篩選標記基因由螢光報告基因和抗藥性基因組成。在本發明的一些實施方式中所述篩選標記基因中的螢光報告基因為gfp基因，抗藥性基因為抗嘌呤黴素基因。
在本發明的一些實施例中，本發明提供的重組細胞株的製備方法中，步驟(1)中所述人α1-抗胰蛋白酶基因、篩選標記基因、aavs1位點的左、右同源臂、loxp的排列方式具體為：aavs1位點的左同源臂、表達人α1-抗胰蛋白酶的基因、loxp、gfp基因、抗嘌呤黴素基因、loxp、aavs1位點的右同源臂依次排列；且這兩個loxp的插入方向相同。
在本發明的一些實施例中，本發明提供的製備方法中步驟(1)的具體步驟為：取genome-crisptmhumanaavs1safeharborgeneknock-inkits(genecopoeia,inc.)產品dc-don-sh01中的人α1-抗胰蛋白酶表達質粒，該質粒中含有aavs1靶點兩側各800bp左右的同源臂；且兩同源臂之間包含帶有調控元件的人α1-抗胰蛋白酶基因(即表達人α1-抗胰蛋白酶的基因)、t2a連接的gfp基因和抗嘌呤黴素基因(即表達篩選標記的基因)；對該質粒進行如下改造：在上述質粒的表達篩選標記的基因兩側分別插入一個同向的loxp序列。
優選地，本發明提供的重組細胞株的製備方法中，步驟(2)中靶向aavs1位點的crispr/cas9的載體的靶點序列如seqidno:3所示。在本發明的一些實施例中，所用的靶向aavs1位點的crispr/cas9的載體為質粒，更具體為genecopoeia公司的genome-crisptm質粒。
在本發明的另外一些實施例中，本發明提供的製備方法中，步驟(3)中獲得所述篩選標記陽性的細胞株所用的篩選方法具體為：先經過嘌呤黴素篩選48小時，後經過綠色螢光gfp篩選單細胞克隆，最後經過接口pcr驗證基因定點整合在hek293細胞的19號染色體的aavs1位點，即得。
在本發明的另外一些實施例中，本發明提供的製備方法中，步驟三中獲得所述篩選標記陰性的細胞株所用的篩選方法具體為：取所述篩選標記陽性的細胞株，轉染表達cre酶的質粒，通過篩選gfp陰性細胞克隆，並經過pcr驗證基因組中含有表達人α1-抗胰蛋白酶的基因並且不含gfp和抗嘌呤黴素基因，即獲得不含篩選標記、穩定表達人α1-抗胰蛋白酶的重組細胞株。
本發明提供的重組細胞株的製備是通過crispr/cas9基因編輯技術結合同源重組實現的。其中，crispr/cas9的靶序列在人的基因組aavs1位點，當crispr/cas9質粒和含所述表達人α1-抗胰蛋白酶的基因、表達篩選標記的基因和所述aavs1位點的左、右同源臂的表達載體共轉染hek293細胞後，crispr/cas9系統在靶位點處剪切dna，形成雙鏈缺口；在存在含有同源臂的所述表達載體的情況下，雙鏈缺口以其為模板，進行同源重組修復，實現目的基因在靶點處的定點插入。轉染後的細胞經過嘌呤黴素篩選，獲得轉基因細胞。轉基因細胞經過有限稀釋進行gfp陽性細胞單克隆篩選。篩選獲得的細胞單克隆經過pcr檢驗，確定在靶位點處是否發生了基因重組，從而排除隨機整合克隆。之後通過表達cre酶的質粒對篩選得到的細胞株進行再次轉染，篩選切除了篩選標記的細胞單克隆，即獲得不含篩選標記、穩定表達α1-抗胰蛋白酶的細胞株。
如上所述構建方法製備得到的重組人的體細胞在分泌表達人α1-抗胰蛋白酶中的應用。通過本發明的構建方法製備的重組體細胞株中，人α1-抗胰蛋白酶基因定點插入到人19號染色體的aavs1位點，該細胞株能夠表達人α1-抗胰蛋白酶，可用於製備重組人α1-抗胰蛋白酶。
更優選地，一種表達人α1-抗胰蛋白酶的重組體細胞株的構建方法，包括如下步驟：
(1)在genome-talertm貨號為dc-don-sh01的aavs1供體克隆載體的篩選標記基因的兩側分別插入一個loxp序列，且這兩個loxp序列的方向一致，得到改造的表達人α1-抗胰蛋白酶的重組質粒，loxp序列如seqidno:4所示；
(2)將步驟(1)改造的重組質粒和靶向aavs1位點的crispr/cas9質粒共轉染人的體細胞，篩選獲得定點整合的體細胞，靶向aavs1位點的crispr/cas9質粒為genecopoeia公司的genome-crisptm質粒；
(3)以表達cre酶的質粒轉染步驟(2)獲得的定點整合的體細胞，通過cre/loxp系統切除篩選標記，篩選獲得切除了篩選標記且穩定表達重組α1-抗胰蛋白酶的體細胞株。
優選地，所述重組細胞株分泌表達人α1-抗胰蛋白酶的方法為，培養所述重組細胞株至細胞密度為75％～95％，更換培養基，繼續培養20h～28h，收集上清液，即得。
在本發明的一些實施例中，本發明提供人α1-抗胰蛋白酶的方法，具體包括：將本發明提供的重組細胞株hek293置於適合細胞生長的培養環境中，使所述細胞長至90％，更換無血清培養基繼續培養24小時，收集細胞上清，即得。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
本發明通過crispr/cas9輔助的同源重組技術實現的人α1-抗胰蛋白酶基因在人的體細胞的基因組aavs1位點的定點重組，同時去除了篩選標記，獲得切除了篩選標記且穩定表達重組α1-抗胰蛋白酶的體細胞。此方法可以使重組人α1-抗胰蛋白酶組成型表達，避免了基因表達衰減、沉默等現象。以人的體細胞，尤其是hek293細胞為宿主，表達的重組α1-抗胰蛋白酶的結構和功能更類似於天然的α1-抗胰蛋白酶，更有利於人α1-抗胰蛋白酶製劑的推廣和應用。
附圖說明
圖1為帶有靶點同源臂的表達質粒載體改造前後示意圖，其中圖1-a為改造前質粒的結構，圖1-b為改造後的質粒的結構。
圖2為改造後載體酶切驗證圖。
圖3為crispr/cas9切靶點形成雙鏈缺口後，同源重組修復介導的基因插入原理示意圖。
圖4為接口pcr檢測示意圖；其中，5』接口pcr產物長度為1.1kb；3』接口pcr產物長度為1.2kb。
具體實施方式
下面結合說明書附圖和具體實施例對本發明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑和材料。
人α1-抗胰蛋白酶基因全長1257bp，編碼418個胺基酸，所述人α1-抗胰蛋白酶具有如seqidno:1所示的胺基酸序列；其基因具有如seqidno:2所示的核苷酸序列。
實施例1
一種表達人α1-抗胰蛋白酶的重組hek293細胞株，具體構建方法如下。
一、載體改造：含有aavs1靶位點左右同源臂、篩選標記基因、人α1-抗胰蛋白酶基因的質粒有很多商業化的品種，本實施例使用genome-crisptmhumanaavs1safeharborgeneknock-inkits(genecopoeia,inc.)產品dc-don-sh01中的人α1-抗胰蛋白酶表達質粒。該表達質粒上帶有aavs1靶點兩側的同源臂，左同源臂長度782bp，為緊鄰靶點左側的序列。右同源臂長度819bp，為緊鄰靶點右側的序列，同時質粒上還帶有表達篩選標記的基因，該質粒的結構如圖1-a所示。
通過酶切連接技術，在表達載體的表達篩選標記的基因的兩側分別插入一個loxp序列，且保證兩個loxp序列方向一致，改造後的質粒的結構如圖1-b所示。具體步驟如下：
1.將產品dc-don-sh01中的人α1-抗胰蛋白酶表達質粒用bglii和asisi雙酶切，回收約10k的片段作為線性載體。
2.設計退火雜交引物loxp1-f/r。序列如下：
loxp1-f:gatctataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgcggccgcaaggatctgcgat
loxp1-r:cgcagatccttgcggccgcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttata
兩條引物雜交後與步驟1的線性化載體連接、轉化，然後菌液pcr篩選。篩選引物為loxp1-seqf/loxp1-r，擴增出來176bp為陽性克隆，並送測(其中，測序引物loxp1-seqf:catcgcattgtctgagtagg)，得到構建好的中間質粒，標記為ha-aat-loxp1，至此，引入5』loxp序列。
3.以構建好的中間質粒ha-aat-loxp1為載體，用sacii-hpai酶切。用loxp2-f/r為引物擴增原始載體ha-aat為片段，大小為571bp。引物序列如下：
loxp2-f：gtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagc
loxp2-r：
ataagctgcaataaacaagttaacataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattgatacaaaggcattaaagc
將這個片段與經sacii和hpai酶切後的ha-aat-loxp1線性化載體按照5:1摩爾比連接、轉化後進行菌液pcr篩選。所用篩選引物為：loxp2-seqf1/seqr1：
loxp2-seqf1:tcgccgccgcgttcgccgac
loxp2-seqr1:catttgagtcaattccagac
選擇陽性克隆，並測序(其中，測序引物loxp2-seqr1:catttgagtcaattccagac)，得到構建好的質粒，至此引入3』loxp序列，得到最終構建載體ha-aat-loxp2，即改造後的含表達人α1-抗胰蛋白酶的基因、表達篩選標記的基因和aavs1位點的左、右同源臂的表達質粒，ha-aat-loxp2質粒的左右同源臂之間的序列如seqidno：5所示。
二、細胞轉染：所述靶向aavs1位點的crispr/cas9質粒為genome-crisptmhumanaavs1safeharborgeneknock-inkits(genecopoeia,inc.)產品hcp-aavs1-cg02，靶點序列ggggccactagggacaggat。
將hek293細胞接種於六孔板中培養(相應的條件為：含gibico胎牛血清10％的dmem培養基，37℃，5％的co2，培養24小時左右)，待細胞生長至80％左右，進行轉染。按照下述步驟操作：
1、crispr/cas9質粒和改造後的含有同源臂的人α1-抗胰蛋白酶基因表達質粒共2微克以1:1的摩爾比混勻後，與250微升opti-mem無血清培養基混勻，並靜置5分鐘。同時，取10微升lipo2000轉染試劑與等量的250微升opti-mem無血清培養基混勻，靜置5分鐘。
2、5分鐘後，將這兩個混合液充分混勻，靜置20分鐘。
3、細胞轉染前用pbs清洗一次，將上述混合液均勻滴加到待轉染的細胞表面。
4、6小時後，加500微升含40％胎牛血清的細胞培養基，繼續培養。
5、轉染後24小時，進行傳代培養。
6、培養基中加入2μg/ml的嘌呤黴素篩選48h，獲得嘌呤黴素陽性的細胞株。
7、有限稀釋法進行gfp陽性細胞單克隆篩選。
crispr/cas9質粒進入細胞，編碼的cas9核酸酶在引導rna的指引下，結合在靶點序列上，並特異切割染色體靶點位置形成雙鏈斷裂缺口。dna雙鏈斷裂缺口引發細胞的dna修復程序。在存在含有同源臂的人α1-抗胰蛋白酶基因表達質粒的情況下，同源臂與染色體上的同源序列通過鹼基互補配對形成雜合鏈，並以含有同源臂的人α1-抗胰蛋白酶基因表達質粒為模板，對缺口進行修復，從而將人α1-抗胰蛋白酶基因整合到缺口位置。
圖2示crispr/cas9切靶點形成雙鏈缺口後，同源重組修復介導的基因插入原理示意圖。
三、按常規操作對所得細胞株分別進行接口pcr和westernblot鑑定。
接口pcr鑑定：靶向aavs1的crispr/cas9結合同源重組介導表達人α1-抗胰蛋白酶的基因在人19號染色體的aavs1位點定點整合，故分別用5』末端接口pcr引物(f：ccggaactctgccctctaac；r：cccgtgagtcaaaccgctat)和3』末端接口pcr引物(f：agctcatctggtctcccttcc；r：tcctgggataccccgaagag)進行擴增，以確定基因的整合。具體方法為：提取細胞dna為模板，稀釋至200ng/μl。maxdnapolymerase(takara)5μl，模板1μl，2微摩爾的引物各1μl，加水補足10μl體系。採用兩步法pcr擴增：98℃預變性20s，55℃退火15s，72℃延伸20s，30個循環。
westernblot鑑定：將重組細胞株培養於75cm2細胞瓶中，待細胞長至80％，換無血清培養基培養24h。收集細胞培養上清，進行sds-page電泳。用abcam的兔抗人α1-抗胰蛋白酶多抗作為一抗，羊抗兔igg作為二抗進行westernblot檢測。
選擇篩選結果為陽性的細胞克隆，即接口pcr兩端均為陽性，且westernblot檢測顯示有條帶的細胞克隆。圖3示接口pcr檢測示意圖；其中，5』接口pcr產物長度為1.1kb；3』接口pcr產物長度為1.2kb。
四、對上述的細胞克隆進行二次轉染：將篩選結果為陽性的細胞克隆接種於六孔板中(相應的條件可以為：含gibico胎牛血清10％的dmem培養基，37℃，5％的co2，培養24h左右)，待細胞生長至80％左右，進行轉染。可根據下述步驟操作：
1、將cre酶質粒2μg，與250μl的opti-mem無血清培養基混勻，並靜置5min。同時，取10μl的lipo2000轉染試劑與等量的250μl的opti-mem無血清培養基混勻，靜置5min。
2、5分鐘後，將二混合液充分混勻，靜置20分鐘。
3、細胞轉染前用pbs清洗一次，將上述混合液均勻滴加到細胞表面。
4、6小時後，加500微升含40％胎牛血清的細胞培養基，繼續培養。
5、轉染後24小時，進行傳代培養。
6、有限稀釋法進行單克隆篩選，獲得gfp陰性細胞單克隆。
7、提取gfp陰性細胞單克隆基因組dna，pcr檢測，篩選無gfp(引物gfp-f：ggctacggcttctaccacttcg；gfp-r：gtgttgctgtgcagctcctcc；產物443bp)、無嘌呤黴素(引物puro-f:atgaccgagtacaagcccacgg；puro-r:cgggtcgactctagaggatcc；產物600bp)基因條帶的細胞克隆，即獲得不含篩選標記、穩定表達人α1-抗胰蛋白酶的重組細胞株。
五、酶活性檢測：將重組細胞株培養於75cm2細胞瓶中，待細胞長至80％，換無血清培養基培養24小時。收集細胞培養上清，進行α1-抗胰蛋白酶酶活檢測。
具體方法為：以sigma的α1-抗胰蛋白酶標準品進行梯度稀釋，並與過量的彈性蛋白酶孵育20分鐘，檢測剩餘活性彈性蛋白酶的量(通過化學發光檢測405納米吸光度，反應彈性蛋白酶底物suc-ala-ala-ala-pna(sigma)的分解底物含量)。以所得結果作為標準曲線，檢測培養上清中人α1-抗胰蛋白酶活性含量為0.4g/l。
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深圳市衛光生物製品股份有限公司
一種表達人α1-抗胰蛋白酶的重組細胞株及其應用
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