一種用於清除工業廢水汞汙染的重組質粒、構建方法、重組工程菌及應用的製作方法
2023-05-30 02:05:26 5
一種用於清除工業廢水汞汙染的重組質粒、構建方法、重組工程菌及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於清除工業廢水汞汙染的重組質粒、構建方法、重組工程菌及應用，所述重組質粒是在質粒pET28a的基礎上插入菸草葉綠體rrn16基因強啟動子、大腸桿菌T7噬菌體基因10的5』UTR序列中的核糖體結合位點保守序列、菸草葉綠體rps16基因的3』端非編碼區、產氣腸桿菌聚磷激酶基因ppk和假單胞菌K-62菌株去掉merA、merG後的mer操縱子構建而成。本發明通過merT-merP將廢水中的有機汞和無機汞轉運到細菌細胞內，通過merB1和merB2將有機汞降解為二價汞，通過ppk將二價汞螯合在細胞內，降低汞對細菌細胞的毒性，將廢水中的汞積累在細菌細胞內，通過收集重組工程菌菌體清除廢水中的汞汙染。
【專利說明】—種用於清除工業廢水汞汙染的重組質粒、構建方法、重組工程菌及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用於清除工業廢水汞汙染的重組質粒，同時還涉及該重組質粒的構建方法、包含該重組質粒的重組工程菌及該重組工程菌的應用，屬於基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]土壤是人類賴以生存的主要自然資源之一，也是人類生態環境的重要組成部分。隨著工業、城市汙染的加劇和農用化學物質種類、數量的增加，土壤重金屬汙染日益嚴重。汞是其中一種主要的重金屬汙染物。農用土壤重金屬汙染主要來自於汙水灌溉。據我國農業部進行的全國汙灌區調查，在約140萬公頃的汙水灌區中，遭受重金屬汙染的土地面積佔汙水灌區面積的64.8%，其中輕度汙染的佔46.7%，中度汙染的佔9.7%，嚴重汙染的佔
8.4%。因此，在廢水排出工廠前進行去汞處理，對於保障人類身體健康非常重要。
[0003]廢水中的汞主要有三種形態:金屬汞、無機汞和有機汞,其中有機汞的毒性最大。運用生物方法對被汞汙染的廢水進行處理能夠將對周圍環境的影響降低到最小程度。在目前已知的對萊具有耐受性的生物中，假單胞菌(Pseudomonas) K_62菌株對萊的耐受性最強，其對汞的耐受性比大腸桿菌高1000倍左右。該菌具有對汞極強的耐受能力主要起因於該菌細胞內的兩個質粒:pmr26和pmr28。pmr26含有兩個抗萊操縱子mer,這兩個操縱子之間相隔Ikb左右，其中一個操縱子使該菌對無機汞和有機汞都具有抗性，而另一個操縱子對有機萊則非常敏感。將這兩個操縱子分別插入到質粒pBluescript II,並命名為pmral7和pmrbOl。測序後發現操縱子pmral7含有6個開放閱讀框,其中5個分別被鑑定為merR、merT、merP、merA、merBl。操縱子pmrbOl含有三個開放閱讀框，分別被鑑定為merR、merB2、merDo MerR是一個調苄基因,對結構基因的轉錄進行正向調控或負向調控；merD與轉錄共調控的功能相關；merT、merP、merA、merB分別編碼二價萊離子轉運蛋白、二價萊離子外周胞質結合蛋白、汞離子還原酶和有機汞裂解酶。在多數情況下，merB緊挨著位於merA的下遊。PseudomonasK-62對有機萊的抗性主要源於merBl和merB2編碼的裂解酶。MerBl負責將甲基汞轉化為二價汞，merB2負責將苯基汞轉化為二價汞，merA負責將二價汞還原為零價汞。轉運蛋白merT和merP負責將有機汞和無機汞運輸到細胞內，並將零價汞從外周胞質中清除出去。MerG位於merA和merB I之間,其預測的胺基酸序列含有一個引導序列,該引導序列包含一個親水區域和一個信號肽剪切位點；該信號序列與已知的外胞周質蛋白的引導序列同源。MerG位於外胞周質上；將merG刪除以後，細菌對二價汞的抗性並沒有發生改變，但是對苯基汞的抗性變弱了 ；刪除掉merG對於merA和merB編碼的酶的活性也沒有影響。表明merG只參與了對苯基汞的抗性，其機理可能是降低了細胞對苯基汞的通透性。
[0004] 綜上所述，Pseudomonas K_62對汞具有極強抗性的機理是它能夠將細胞內的有機
汞轉化為二價汞，然後將二價汞轉化為零價汞，如下:
[0005]
【權利要求】
1.一種用於清除工業廢水汞汙染的重組質粒，其特徵在於，所述重組質粒是在質粒pET28a的基礎上插入菸草葉綠體rrnl6基因強啟動子、大腸桿菌T7噬菌體基因10的5』UTR序列中的核糖體結合位點保守序列、菸草葉綠體rpsl6基因的3』端非編碼區、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)聚憐激酶基因ppk和假單胞菌(Pseudomonas) K-62菌株去掉merA、merG後的mer操縱子構建而成。
2.根據權利要求1所述的用於清除工業廢水汞汙染的重組質粒，其特徵在於，包含有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
3.一種用於清除工業廢水汞汙染的重組質粒的構建方法，其特徵在於，包括以下步驟: (O根據假單胞菌K-62菌株質粒pmr26和pmr28，合成人工操縱子merT-merP-merBl-merB2,將其與質粒pET28a進行連接,連接產物轉化大腸桿菌DH5a,篩選陽性克隆過夜培養，提取質粒，酶切和測序鑑定結果與預期相符的質粒，命名為Pl ； (2)以產氣腸桿菌DNA為模板，設計引物，擴增ppk基因；將ppk基因和質粒pi酶切後進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養，提取質粒，酶切和測序鑑定結果與預期相符的質粒，命名為p2 ； (3)設計引物，擴增含有菸草葉綠體rrnl6基因強啟動子和大腸桿菌T7噬菌體基因10的5』 UTR序列中的核糖體結合位點保守序列； (4)將含有菸草葉綠體rrnl6基因強啟動子和大腸桿菌T7噬菌體基因10的5』UTR序列中的核糖體結合位點保守序列和質粒pET28a酶切後進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養，提取質粒，酶切和測序鑑定結果與預期相符的質粒，命名為p3 ； (5)以質粒p2為模板，設計引物，擴增人工操縱子merT-merP-merBl-merB2-ppk;將merT-merP-merBl-merB2-ppk和質粒p3酶切後進行連接,連接產物轉化大腸桿菌DH5a,篩選陽性克隆過夜培養，提取質粒，酶切和測序鑑定結果與預期相符的質粒，命名為P4 ； (6)以菸草葉綠體DNA為模板，設計引物，擴增rpsl63』端非編碼區基因序列；將rpsl63』端非編碼區基因與質粒p4酶切後進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養，提取質粒，酶切和測序鑑定結果與預期相符的質粒即為用於清除工業廢水汞汙染的重組質粒。
4.一種用於清除工業廢水汞汙染的重組工程菌，其特徵在於，所述重組質粒是在質粒pET28a的基礎上插入菸草葉綠體rrnl6基因強啟動子、大腸桿菌T7噬菌體基因10的5』UTR序列中的核糖體結合位點保守序列、菸草葉綠體rpsl6基因的3』端非編碼區、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)聚憐激酶基因ppk和假單胞菌(Pseudomonas) K-62菌株去掉merA、merG後的mer操縱子構建而成。
5.根據權利要求4所述的用於清除工業廢水汞汙染的重組工程菌，其特徵在於，所述重組工程菌的宿主為大腸桿菌BL21。
6.一種如權利要求4所述的重組工程菌在清除工業廢水汞汙染方面的應用。
【文檔編號】C12N15/66GK103525849SQ201310507408
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月24日 優先權日:2013年10月24日
【發明者】舒海燕, 常勝合 申請人:舒海燕, 常勝合