利用天然油體重構法製備固定化脂肪酶用於生產生物柴油的製作方法

2023-06-04 18:26:36

專利名稱：利用天然油體重構法製備固定化脂肪酶用於生產生物柴油的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種以基因工程的方法表達脂肪酶，並使用天然油體作為固定化酶基質以製備固定化脂肪酶來生產生物柴油的方法。
背景技術：
1.生物酶法製備生物柴油的概況
生物酶法製備生物柴油是利用脂肪酶的酯化和轉酯反應活性，催化油脂和醇反應生成生物柴油。與物理法和化學法相比，用脂肪酶作催化劑製備生物柴油，具有應用範圍廣、原料選擇性較低、催化效率高、反應條件溫和及對環境友好、醇用量少、後處理簡單、無汙染物排放、副產物甘油較易分離等優點。目前，天然的脂肪酶作為催化劑來生產生物柴油存在著一定的局限性，主要有 (1)脂肪酶對低鏈醇的轉化率較低，致使脂肪酶用量過大、反應周期過長，脂肪酶的轉酯反應活性有待進一步提高；( 短鏈醇特別是甲醇對脂肪酶有一定的毒性，酶的使用壽命縮短，生產成本過高，脂肪酶的甲醇耐受性也必須進一步改善。正是這些因素制約著酶法生產生物柴油的大規模應用。固定化酶是在一定空間內呈閉鎖狀態存在的酶，能連續地進行反應，反應後的酶可以回收重複利用。將游離脂肪酶固定在載體上催化反應合成所需要的產物，使昂貴的脂肪酶得以重複使用，降低了反應的成本。且固定化酶具有可以回收，重複使用，穩定性高，產品質量高等優點。因此，固定化脂肪酶應用前景被普遍看好。2.脂肪酶的固定化方法
當前固定化脂肪酶的方法很多，可概括為物理法、化學法及生物法。由於載體材料、製備方法及固定酶的來源等不同，導致製備固定化酶的難易程度、固定效果、酶的穩定性等也有所不同。物理方法，包括吸附法和包埋法。吸附法是通過物理吸附將酶固定於纖維載體的一種固定化方法。物理吸附法具有酶活性中心不易被破壞和酶高級結構變化少的優點，另外，吸附過程可以同時達到純化和固定化的目的，且酶失活後可重新活化再生。因而酶活力損失較少，若能找到適當的載體，這是很好的方法。包埋法是將酶物理包埋於多聚物內以達到固定化的目的。包埋法一般不需要與酶蛋白的胺基酸殘基進行結合反應，很少改變酶的高級結構，因此酶活回收率較高。但是在包埋時發生化學聚合反應，酶容易失活，必須巧妙設計反應條件，使之化學反應時不至於破壞酶的活性部位和活性中心。北京化工大學研究者將自有菌株發酵提取的脂肪酶(Candida sp. 99-12 用硅藻固定，採用酯化法直接將脂肪酸與甲醇反應，油酸和甲醇摩爾比為1 1.4，反應過程中加入矽膠作吸水劑，反應Mh，酯化率可達92%。^mi Watanabe等人運用固定的假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶催化豆油與甲醇反應中獲得了 93. 8%的轉酯率，並且其固定化酶循環25次之後活性沒有發生任何改變。官春雲等用硅藻土對實驗室篩選得到的成團腸桿菌脂肪酶乾燥酶粉進行固定化，轉酯率達到91. 03%。
化學法主要是採用共價結合法。該方法是通過酶分子之間或酶蛋白分子的功能團與載體表面上的反應基團之間以共價鍵相互連接，形成固定化酶。羅文等以多孔玻璃為載體，採用共價法對假絲酵母99-125脂肪酶進行了固定，並以所製備的固定化酶為催化劑， 在溫水體系中利用菜籽油合成生物柴油，採用3次流加甲醇的方式在石油醚中合成生物柴油，每一批次反應後過濾出固定化酶，用叔丁醇清洗後繼續進行下一批次的反應，固定化酶連續反應13批(每批30 h)後，生物柴油反應轉化率仍維持在70%以上。固定化脂肪酶的半衰期在390 h以上。生物法是採用分子生物學手段將目的基因克隆表達並將表達蛋白進行固定從而製備固定化酶的方法。當前生物法製備固定化脂肪酶主要是採用全細胞固定法。全細胞固定化法是將產脂肪酶的微生物直接固定到支持物上，從而製備全細胞催化劑，這種方法比固定化酶更為簡便、經濟，而且固定化過程可在批量化發酵時同步完成，不僅省去了分離純化的過程，而且又避免在提取，純化過程中酶的損失。根據全細胞催化劑的發展歷程和固定方法的差異，主要分為真菌全細胞催化劑、酵母全細胞催化劑、大腸桿菌全細胞催化劑三種。kizaburo Shiraga等將稻根黴菌脂肪酶固定到釀酒酵母菌表面，與游離脂肪酶相比， 所得固定化脂肪酶催化軟脂酸和η-戊醇(0.2 %水存在)的轉酯活性得到了巨大的提高。 Hama等將根黴菌lihizopus oryzae細胞固定在聚氨酯泡沫體BSI3s中，在一個20L的填充床生物反應器中進行間歇培養。流速為25L / h時在第一個生產周期甲酯含量超過90%，第 10個周期後可以達到80%。Kazuhiro等將根黴菌Iihizopus oryzae固定在聚氨酯泡沫體顆粒上，採用分3次加入甲醇的方式，當反應體系中含有質量分數為15%的水時，甲酯得率可以高達90%。經過6次回用，胞內脂肪酶的活性並沒有明顯的下降。同時還發現利用不同的脂肪酸作為碳源，全細胞催化劑的催化活性和穩定性也不同，不飽和脂肪酸有利於提高細胞膜的通透性，使酶催化活性提高，而飽和脂肪酸有利於提高細胞的剛性，使酶穩定性提高。Matsumoto等構建了能大量表達米根黴脂肪酶(lihizopus oryzae lipase)的酵母菌株MT821，其胞內脂肪酶的活性達到474. 5 IU / L0用預先經凍融或風乾方法增強了滲透性的酵母細胞來催化大豆油合成脂肪酸甲酯，在37°C時以逐步添加甲醇的方式反應165h， 最後反應液中脂肪酸甲酯質量分數達到71%。該法省去了分離和外部固定化的步驟。3.現有生物柴油生產中脂肪酶固定化方法的評價及發展趨勢
雖然固定化酶法製備生物柴油具有條件溫和、醇用量小、產品易於收集、無汙染排放等優點，是一種很有潛力的綠色生產方法。但目前實際生產中仍未廣泛使用，主要是由於在生物柴油的生產中他們都存在著一些嚴峻的缺陷物理法製備固定化脂肪酶具有操作簡單、 成本較低的優點，但達不到純化的目的，而且包埋法只適用於分子量比較小的底物和產物的酶催化反應；化學法生產的固定化脂肪酶具有結合牢固、不易脫落、可連續使用時間較長等優點，但在固定過程中不可避免地會導致酶部分活性位點的損失，從而降低酶的活力。 反應條件苛刻、操作複雜、酶活回收率低，甚至酶的底物專一性有時也會發生變化，並且在操作過程中常常會引起酶蛋白高級結構發生變化，從而導致活性中心受到破壞，其重複性不高，從而不適於生物柴油的生產。此外，因為必須對脂肪酶進行一定的分離提純才能獲得較高的固定化效率，使得固定化脂肪酶法的生產成本依然較高，限制了其在實際生產中的應用。全細胞固定化脂肪酶操作簡單、成本低，但是存在一個最大的問題是目的蛋白(脂肪酶)的量無法得到充分的提高。
綜上分析固定化脂肪酶生產生物柴油今後的研究重點，仍然在於尋找更好的固定化材料和固定化方法，進一步改善固定化酶的相對活力、熱穩定性、低碳醇耐受性和催化底物適用範圍等性能。入背景技術描述段落。

發明內容
本發明是利用天然油體重構法同步純化和固定化脂肪酶，該發明提供了一種全新的脂肪酶固定化技術可用於生產生物柴油，解決了當前酶法生產生物柴油過程中固定化脂肪酶成本高、效率低的缺點。本發明的特徵在於該方法步驟如下利用天然油體崩解後能自發重構的特點，以油脂植物總mRNA的反轉錄產物cDNA為模板，採用PCR法獲得的40(Tl000bp的油體蛋白基因，標記為0。以根據文獻《廉價油脂青睞型脂肪酶產生菌株的篩選及其鑑定》的方法獲得的產脂肪酶微生物基因組為模板採用PCR法獲得信號肽缺失的脂肪酶及其伴侶蛋白基因的ORF序列，標記為Lipd25AB。利用《分子克隆實驗指南3》上基因工程的方法構建油體蛋白和脂肪酶及其伴侶蛋白表達載體PET32 (a+)-0-Lipd25AB。將該原核表達載體轉入表達宿主菌E. coli BL2KDE3)中，獲得用於表達融合蛋白(油體蛋白-脂肪酶)的工程菌株E. coli BL21(DE3) -0-Lipd25AB。將誘導表達的工程菌株與天然油體按比例混合後超聲處理，利用油體蛋白的特異疏水性使融合蛋白錨定到新組成的油體半單位膜上，形成含有脂肪酶的重構油體即固定化脂肪酶。利用所製備的固定化脂肪酶催化動植物油脂的轉酯反應獲得生物柴油。所述的脂肪酶是用天然油體重構技術固定的脂肪酶，用於製備生物柴油。所述的天然植物油體來源於油脂植物種子如麻瘋樹種子、油菜籽、擬南芥種子、 大豆、花生、棉籽、棕櫚、椰子等天然油體。所述的天然油體與含表達載體的大腸桿菌合併混勻進行超聲波處理條件為功率 20%- %;破碎時間5-10min，將超聲處理後的混合物於10 000 g離心10 min，收集上層白色物質，即為天然油體固定化脂肪酶。所獲得的油體蛋白基因大小在40(Tl000bp。脂肪酶基因來源可為根據文獻《廉價油脂青睞型脂肪酶產生菌株的篩選及其鑑定》的方法獲得的產脂肪酶的不同微生物。所述的轉酯反應包括將收集的天然油體固定化脂肪酶加入到含有脂溶性有機溶劑、動植物油脂的密閉容器中，然後加入低元醇及水後放於相應溫度的搖床中進行轉酯反應，每隔一段時間再加入相應量的低元醇，連續多次，轉酯後獲得相應的脂肪酸酯即為生物柴油。所述的油脂是一種或多種選自麻瘋樹種子油、菜籽油、豬油、大豆油、花生油、棉籽油、棕櫚油、椰子油、食用廢油、皂角或酸化油等的動植物油脂。所述的低元醇為甲醇、乙醇、乙酸乙酯等，可以一次或多次加入。所述的轉酯反應參數為溫度15 - 45°C，搖床轉速70 - 200 r/min，每隔5_10 h 再加入相應量的低元醇，連續3-5次。本發明採用天然油體重構技術來固定化脂肪酶達到了同步固定及高效純化的目的，簡化了製備固定化酶的工藝；其次，天然油體固定化酶用於轉酯反應後經過簡單的處理或自然崩解，其主要成分(油脂)可以作為生物柴油生產底物循環利用，不僅達到了資源的充分利用而且有利於環保；再次，本發明首次採用天然油體作為固定化酶的基本材料，不僅成本低廉，而且顯著提高了脂肪酶的穩定性以及對低元醇的耐受能力。
權利要求
1.一種使用天然油體作為固定化酶基質以製備固定化脂肪酶來生產生物柴油的方法， 其特徵在於該方法步驟如下利用天然油體崩解後能自發重構的特點，以油脂植物總mRNA 的反轉錄產物cDNA為模板，採用PCR法獲得的40(Tl000bp的油體蛋白基因，標記為0 ；以根據文獻《廉價油脂青睞型脂肪酶產生菌株的篩選及其鑑定》的方法獲得的產脂肪酶微生物基因組為模板採用PCR法獲得信號肽缺失的脂肪酶及其伴侶蛋白基因的ORF序列，標記為Lipd25AB ；利用《分子克隆實驗指南3》上基因工程的方法構建油體蛋白和脂肪酶及其伴侶蛋白表達載體pET32(a+)-0-Lipd25AB ；將該原核表達載體轉入表達宿主菌Ε. coli BL21(DE3)中，獲得用於表達融合蛋白(油體蛋白-脂肪酶)的工程菌株Ε. coli BL21(DE3) -0-Lipd25AB;將誘導表達的工程菌株與天然油體按比例混合後解構處理，利用油體蛋白的特異疏水性使融合蛋白錨定到新組成的油體半單位膜上，形成含有脂肪酶的重構油體即固定化脂肪酶；利用所製備的固定化脂肪酶催化動植物油脂的轉酯反應獲得生物柴油。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的脂肪酶是用天然油體重構技術固定的脂肪酶，用於製備生物柴油。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的天然植物油體來源於油脂植物種子如麻瘋樹種子、油菜籽、擬南芥種子、大豆、花生、棉籽、棕櫚、椰子等天然油體。
4.如權利要求1所述的方法，所獲得的油體蛋白基因來源於油脂植物如麻瘋樹、油菜、擬南芥、大豆、花生、棉籽、棕櫚、椰子等，大小在40(Tl000bp。
5.如權利要求1所述的方法，脂肪酶基因來源可為根據文獻《廉價油脂青睞型脂肪酶產生菌株的篩選及其鑑定》的方法獲得產轉酯酶活脂肪酶的不同微生物。
6.如權利要求1所述的方法，其轉酯反應包括將收集的天然油體固定化脂肪酶加入到含有親脂性有機溶劑、動植物油脂的密閉容器中，然後加入低元醇及水後放於相應溫度的搖床中進行轉酯反應，每隔一段時間再加入相應量的低元醇，連續多次，轉酯後獲得相應的脂肪酸酯即為生物柴油。
7.如權利要求7所述的轉酯反應，其特徵在於所述的油脂是一種或多種選自麻瘋樹種子油、菜籽油、豬油、大豆油、花生油、棉籽油、棕櫚油、椰子油、食用廢油、皂角或酸化油等的動植物油脂。
8.如權利要求7所述的轉酯反應，其特徵在於所述的親脂性有機溶劑可以為正己烷/ 石油醚/叔丁醇/乙醚等。
9.如權利要求7所述的轉酯反應，其特徵在於所述的低元醇為甲醇、乙醇、乙酸乙酯等，可以一次或多次加入。
10.如權利要求7所述的轉酯反應，其特徵在於所述的轉酯反應參數為溫度15-45°C，搖床轉速70 - 200 r/min，每隔5-10 h再加入相應量的低元醇，連續3_5次。
全文摘要
本發明是一種利用天然油體重構法同步純化和固定化脂肪酶的方法，該方法是利用天然油體崩解後能自發重構的特點，將表達有融合蛋白脂肪酶油體蛋白的大腸桿菌與天然油體按比例混合後超聲處理，利用油體蛋白的特異疏水性使融合蛋白錨定到新組成的油體半單位膜上，形成含有脂肪酶的重構油體，從而達到脂肪酶純化和固定化同步完成的目的。該發明提供了一種全新的可用於生產生物柴油的脂肪酶固定化技術，解決了當前酶法生產生物柴油過程中固定化脂肪酶成本高、效率低的缺點，製備工藝簡單；本發明首次採用天然油體作為固定化酶的基質，成本低廉、底物適應性廣泛，並顯著提高脂肪酶的穩定性以及對低元醇的耐受能力。
文檔編號C12P7/64GK102321693SQ20111028311
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月22日 優先權日2011年9月22日
發明者張樹軍, 白方文, 白林含 申請人:四川大學