毛蚶多肽提取物免疫調節新用途的製作方法

2023-06-04 21:36:31

專利名稱：毛蚶多肽提取物免疫調節新用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種海洋生物多肽提取物，即毛蚶多肽提取物的免疫調節作用。
背景技術：
毛紺(Area subcrenata Lischke)俗稱毛蛤,軟體動物門，瓣觸綱,紺目，紺科,毛蚶屬，主要分布於中國、朝鮮和日本沿海。毛蚶營養與藥用價值較高，其殼和肉皆有藥用價值，其中中藥瓦楞子就是以毛蚶的殼炮製而成。中醫認為毛蚶的肉性溫味甘，歸脾、肝經，具溫中健胃、滋陰補血之功效，臨床上主治貧血、體虛等。毛蚶資源豐富，營養價值高，對其軟體部分的進一步的深入研究與藥效方面的開發具有重大的前景。 目前，毛蚶活性成分的研究多為毛蚶多糖、蛋白多肽這兩類大分子物質。其中對毛蚶多糖的提取工藝及其免疫調節活性的研究較多，而對毛蚶蛋白多肽類物質的研究則相對較少，如中國專利申請號98110478. 9公開了 「一種能抗癌的海洋生物提取物」、中國專利申請號03157458. O公開了 「毛蚶中的多肽蛋白類活性物質及其製備方法和用途」、中國專利申請號200510043846. 4公開了 「一種毛蚶糖肽類提取物及其製備方法」、中國專利申請號2005100043797. 4公開了一種「一種毛蚶抗癌肽類提取物及其製備方法」，和200610043222. 7公開了一種「從毛蚶中提取小分子活性多肽的方法」，以上專利報導了毛蚶蛋白、多肽類化合物的提取分離工藝及其抗腫瘤活性，而對於毛蚶多肽提取物的免疫活性方面的研究則未見報導。本發明研究了毛蚶多肽提取物對小鼠免疫細胞功能的調節作用，並初步闡明其免疫調節作用機制，為毛蚶多肽提取物的進一步利用提供科學依據。

發明內容
本發明所解決的技術問題是公開毛蚶多肽提取物對機體的免疫調節作用。發明人通過MTT法測定毛蚶多肽提取物對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響及對小鼠NK細胞殺傷活性的影響；中性紅吞噬法測定毛蚶多肽提取物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響；流式細胞術測定毛蚶多肽提取物所致小鼠脾淋巴細胞周期的變化；雙抗體夾心ELISA法測定毛蚶多肽提取物對主要細胞因子IFN-Y和IL-4分泌水平的影響；RT_PCR法測定毛蚶多肽提取物對T淋巴細胞中T-bet和GATA-3的mRNA表達水平的影響。以上藥效學實驗證明，毛蚶多肽提取物能夠促進未活化的淋巴細胞增殖，也可促進經ConA或LPS活化的T或B淋巴細胞增殖，增強小鼠NK細胞對YAC-I靶細胞的殺傷活性，增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅活力，促進淋巴細胞進入細胞周期，並且能夠調控T淋巴細胞中T-bet和GATA-3的mRNA表達，從而調節Thl和Th2型細胞因子的分泌量，以調節機體的Thl\Th2細胞分化，具有潛在的治療免疫缺陷、與Thl\Th2分化相關的免疫疾病及其相關疾病的作用，亦可用作機體免疫調節保健食品的開發。
本發明相對於現有技術具有如下的優點(I)本發明發現了毛蚶多肽提取物的新用途，毛蚶多肽提取物能夠促進在機體免疫應答中起關鍵作用的三種免疫細胞的功能，即對機體的免疫功能有促進作用。
(2)毛蚶多肽提取物對機體的Thl\Th2細胞分化有調節作用。


圖I.毛蚶多肽提取物對小鼠脾細胞周期分布的影響。圖2.毛蚶多肽提取物對T淋巴細胞T-bet基因表達水平的影響，其中，I為溶媒對照組，2為毛蚶多肽提取物500 μ g/mL組，3為毛蚶多肽提取物100 μ g/mL組，4為毛蚶多肽提取物20 μ g/mL組。圖3.毛蚶多肽提取物對T淋巴細胞GATA-3基因表達水平的影響，其中，I為溶媒對照組，2為毛蚶多肽提取物20 μ g/mL組，3為毛蚶多肽提取物100 μ g/mL組，4為毛蚶多肽提取物500 μ g/mL組。具體實施實例以下結合技術方案和附圖詳細說明本發明的具體實施例。本發明所用動物為SPF級昆明種小鼠，雄性，體重18_22g，購於廣東省醫學實驗動物中心，合格證號SCXK(粵)2008-0002。小鼠淋巴瘤細胞株YAC-I購於中山大學實驗動物中心子細胞庫。實施例I.毛蚶多肽提取物對正常小鼠3種免疫細胞功能的調節作用I. IMTT法測定小鼠脾淋巴細胞轉化率按常規方法製備小鼠脾淋巴細胞懸液，調整細胞密度為5 X IO6個/mL，加入96孔細胞培養板，每孔100 μ L。分為3個處理組毛蚶多肽提取物單藥組、毛蚶多肽提取物+ConA組、毛蚶多肽提取物+LPS組。毛蚶多肽提取物單藥組為每孔分別加入100 μ L含不同濃度毛蚶多肽提取物的RPMI 1640完全培養液，使毛蚶多肽提取物的終濃度分別為31. 25 μ g/mL、62. 5 μ g/mL、125 μ g/mL,250 μ g/mL,500 μ g/L，並設陰性對照組(100 μ L RPMI 1640 完全培養液);毛蚶多肽提取物+Con A組為每孔分別加入100 μ L含上述濃度毛蚶多肽提取物及含5 μ g/mL ConA的RPMI 1640完全培養液，並設陰性對照組(100 μ L含5 μ g/mL ConA的RPMI1640完全培養液);毛蚶多肽提取物+LPS組為每孔分別加入100 μ L含上述濃度毛蚶多肽提取物及含20 μ g/mL LPS的RPMI 1640完全培養液，並設陰性對照組(100 μ L含20 μ g/mL LPS的RPMI 1640完全培養液)，各濃度組均設3復孔。置於37°C、5% CO2培養箱中連續培養48h，取出培養板，每孔加入5mg/mL MTT溶液20 μ L，繼續培養4h，於3000r/min離心30min棄上清,每孔加入DMSO 200 μ L,振蕩IOmin至形成的紫色結晶完全溶解,用酶標儀於570nm波長處測定吸光度(A)值。實驗結果如表I所示，毛蚶多肽提取物單藥組在各個濃度作用下對小鼠脾淋巴細胞的增殖率均有顯著增強作用(P < O. 01)，在濃度為125 μ g/mL以下具有量效關係，濃度大於125 μ g/mL時，增殖率下降；毛蚶多肽提取物協同LPS刺激B細胞，在濃度高於31. 25 μ g/mL時對B細胞的增殖具有顯著的促進作用(P<0.01);毛蚶多肽提取物協同ConA刺激T細胞，在濃度高於62. 5 μ g/mL時有顯著增強作用(P < O. 05或P < O. 01)，具有明顯量效關係，且其對T淋巴細胞的增殖作用強於B淋巴細胞。
表I.毛蚶多肽提取物對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用的影響(無±_s，n = 3)
權利要求
1.毛蚶多肽提取物的免疫調節作用及其在製備免疫疾病相關藥物的應用。
2.如權利要求I所述，其特徵在於毛蚶多肽提取物促進機體免疫細胞功能的作用，及其對機體Thl\Th2細胞分化的調控作用。
3.如權利要求I所述，其特徵在於毛蚶多肽提取物用於製備預防或治療人或動物機體免疫系統疾病製劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種毛蚶多肽提取物的一種新的醫藥用途，特別涉及其在製備具有免疫調節功能藥物中的應用。本發明通過藥理藥效學實驗證明，毛蚶多肽提取物對機體的免疫細胞功能有促進作用，並且能夠調控機體的Th1\Th2細胞分化，有潛力應用於治療免疫缺陷、與Th1\Th2分化相關的免疫疾病及其他相關疾病。本發明確定了毛蚶多肽提取物的新的藥理活性，其藥效機制的闡明為其進一步開發提供科學依據。
文檔編號A61P37/02GK102813676SQ20111015428
公開日2012年12月12日 申請日期2011年6月9日 優先權日2011年6月9日
發明者於榮敏, 黃演君, 宋麗豔 申請人:於榮敏