一種製備重組人促生長激素釋放因子的方法

2023-05-28 06:57:11

專利名稱：一種製備重組人促生長激素釋放因子的方法
技術領域：
本發明涉及一種用遺傳工程重組技術製備人促生長激素釋放因子的方法。
生長激素釋放因子(Growth Releasing Factor，GRF)是下丘腦中最後一個被發現和闡明的神經內分泌因子，1947年Green和Harris推測下丘腦中存在該生長因子，1964年Deuben和Meitas用下丘腦裂解物刺激大鼠垂體分泌生長激素這一實驗證實了GRF的存在。1982年Vale和Guillemin兩個小組分別從患胰腺腫瘤合併肢端肥大症患者的腫瘤組織中純化了GRF，但兩個小組得到的結果並不相同，Vale小組得到的GRF由40個胺基酸組成，而Guillemin小組得到的GRF則是多態的，分別由37、40、44個胺基酸組成，但它們有相同的N端序列，由此人們推斷它們有可能是同一種多肽而降解程度不同，完整的GRF應由44個胺基酸組成，其他均為其降解產物，後來的試驗也證實人促生長激素釋放刺激因子是由44個胺基酸構成的小肽。1985年Mayo，KE等首次進行了GRF基因的序列測定工作，並將GRF基因定位於人20#染色體，全長10kb，有五個外顯子。免疫染色證明其正常分泌的部位是中樞神經系統下丘腦漏鬥部和中部，其它部位也有少量分泌，通常異位大量分泌GRF表明有腫瘤的存在。正常人體內GRF的含量極低，降解比較迅速。生理學和病理學研究表明，GRF能高效、特異地刺激垂體前葉細胞分泌生長激素，並且僅保留其N端29個胺基酸即能保留其全部生物活性。這一特點很快受到人們注意，使之成為治療生長激素缺乏症的潛在藥物。
作為藥物，GRF主要用於治療因生長激素(Growth Hormone，GH)缺乏而引起的各種疾病，比如侏儒症等，特別是針對因下丘腦本身GRF分泌不正常而造成的垂體前葉分泌GH細胞的萎縮。其藥理作用在於(1)患侏儒症及因腎功能失調等原因而導致身高不能達到正常水平的兒童，經過長期、反覆給藥，刺激垂體細胞恢復功能，使GH分泌量達到正常兒童標準。1987年，英國倫敦St.Bartholomew’s醫院R.J.M.Ross等人對18名患GH缺乏症的兒童採用一日二次注射GRF(29個胺基酸)進行治療，結果12名患兒有明顯的身高增長現象，同時，在1983-1985年間，Marie，C.；Stephen，M.及Genevieve，S.等人各自的研究均表明，GRF對正常人的GH含量沒有很大影響，從而完全避免了因使用GRF而造成的副作用特別是肢端肥大症。因此，在目前GH已經限制使用的狀況下，GRF顯然已經成為治療GH缺乏症的首選替代藥物；(2)中老年人及婦女的骨質疏鬆症。GRF可以促進骨組織、軟骨組織細胞的有絲分裂，促進軟骨基質的合成，增加成骨細胞數目，增強骨密度，加強骨骼硬度、韌性，對預防和治療骨質疏鬆均有良效；(3)輔助藥物。包括治療骨折、截肢患者；促進燒傷、燙傷病人的恢復。1994年的美國專利5317012還表明，GRF能夠增加T4/T8淋巴細胞比例，增加機體免疫力，提高抗感染能力，對治療各種免疫缺乏症，特別是AIDS也是一種比較有效的輔助藥物；(4)各種老年性疾病。隨著人們年齡的增加，人體GH的分泌量呈下降趨勢，從而造成機體各個器官的逐漸衰老，GRF能夠不斷刺激GH的分泌，保持體內GH的含量維持在一個穩定的濃度，延緩機體的衰老，保持機體旺盛的生命力，對治療各種老年性疾病有很大幫助；(5)減肥藥物。動物試驗表明，GRF能夠促進脂類代謝，糖類分解，增加蛋白質含量，因此，有人認為GRF也可以作為減肥藥物的一種成份。
由於天然GRF在人體內含量極低，GRF的生產主要通過生化提純---即從胰腺腫瘤中提取，或是化學合成蛋白質的固定化合成的方法，成本很高，得率相對較低。1983年歐洲專利108387中描述了一種生產GRF的方法，他們應用固定化亞磷酸鹽法，根據Guillemin小組由胰腺腫瘤組織中純化的GRF胺基酸序列，反推出的GRF基因序列，在GRF序列的兩端分別加上了EcoRI兩個酶識別位點的3′端SalI酶識別位點的5′端，即在GRF兩端加上了粘性末端，將這種結構的基因分18個片段，分別全序列合成GRF結構基因的兩條鏈編碼鏈及其互補鏈，通過極其複雜的方式將各個片段連接起來，再經過EcoRI，PstI雙酶切，切掉多餘的片段，形成完整的GRF基因，再將其與原核表達質粒pRC23連接，轉化大腸桿菌K12菌株，同時在該菌株中還含有低拷貝的pRK248cIts質粒。pRC23中含由λ噬菌體中的PL啟動子，pRK248cIts質粒中含抑制PL啟動子的cIts857基因，該基因為溫度誘導型突變體，可以通過溫度控制cI基因的活性，即30℃時，cI基因正常表達，PL啟動子受抑制，42℃時，cI蛋白降解，從而啟動GRF基因的表達。該發明沒有得到純化的GRF蛋白。而事實上，由於GRF蛋白本身分子量很小，用這種方法表達的GRF蛋白很容易被大腸桿菌降解而得不到純品。本發明在參考前人的基礎上，又有了很大發展。首先，在設計GRF結構基因時，本發明根據1985年Mayo，KE等測定的人下丘腦GRF的基因序列，在不改變其胺基酸序列的前提下對GRF結構基因進行改造，使其適應於在大腸桿菌中表達，同時，由於小分子多肽的不穩定性，在實驗設計上採用融合蛋白方法表達GRF蛋白，即在GRF基因的5′端加上融合蛋白配體基因，在配體與GRF基因之間再加上一個蛋白酶的識別位點，整個基因將在大腸桿菌中表達融合蛋白。純化後的融合蛋白在蛋白酶的作用下將配體與GRF分開，這樣經過一步很簡單的分子篩分離即可得到GRF純品。其次，本發明在GRF基因的合成方法上做了改進，分別從GRF基因的3′端和5′端，合成兩段寡核苷酸序列，中間有十個鹼基互補，雖然在基因兩端也加上了限制酶切點，但合成的兩個寡核苷酸片段在Klenow酶作用下，形成的是兩端帶有完整限制酶切點的GRF基因的平端序列，而不是如歐洲專利上提到的粘端序列，這樣大大簡化了實驗步驟，合成好的寡核苷酸可以在30分鐘內得到GRF基因，並且可以很方便地將其連接到大腸桿菌的克隆載體上，也有利於進一步的基因操作，詳細的描述見下文。第三，本發明使用的載體是溫度誘導型表達載體，比如由中國預防醫學科學院病毒所設計的pBV220質粒，與pRC23不同的是，它含有源自λ噬菌體的PLPR串聯啟動子，同時質粒本身即帶有cIts857基因，從而不必要求被轉化的菌株必須含有cIts857基因，比如在歐洲專利中所描述的含有pRK248cIts質粒的大腸桿菌K12，可以轉化任何大腸桿菌菌株，在本發明中使用的是大腸桿菌BL21，從而與歐洲發明有著很大區別。1987年Jamila和Anba等在大腸桿菌中表達了經過修飾的GRF，他們使用融合蛋白的方法，將phoS基因與經修飾的GRF基因融合，即在GRF的N端加上一個甲硫氨酸殘基(Met)，並替代GRF中所有甲硫氨酸殘基，在大腸桿菌中表達融合蛋白，純化後用溴化氰(BrCN)切割phoS與GRF融合蛋白，但也未得到基因工程產品。到目前為止，尚未有GRF的基因工程產品問世，各大醫院使用的仍為前兩種方法得到的GRF，其成本高，純化步驟複雜，無法大範圍使用。
本發明的目的，在於克服以往生產中成本高、工序複雜的缺點，發明一種利用基因工程技術製備GRF的新方法，以降低成本，簡化工作程序，得到高純度、高活性、低消耗的成品。
本發明的技術路線詳細描述如下根據1985年Mayo，KE等報導的GRF基因序列，將其編碼區序列單獨取出，如下所示9 18 27 36 455′TAT GCA GAT GCC ATC TTC ACC AAC AGC TAC CGG AAG GTG CTG GGCTyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly54 63 72 81 90CAG CTG TCC GCC CGC AAG CTG CTC CAG GAC ATC ATG AGC AGG CAGGln Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln99 108 117 126 132CAG GGA GAG AGC AAC CAA GAG CGA GGA GCA AGG GCA CGG CTT 3′Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu在不改變其胺基酸序列的情況下，將部分不適宜在大腸桿菌中使用的密碼子替換成使用頻率較高的密碼子，全序列合成經過修飾的GRF基因，採用「搭橋」的策略合成該基因雙鏈DNA，5′端加限制酶識別位點，並將其克隆到載體pUC19上，如圖1所示。
下面現分述部分密碼子的修改可以是哪些在Mayo，KE所測的GRF基因序列中，人體多用TAT作為酪氨酸Tyr的密碼子，而根據大腸桿菌某些核糖體蛋白質中密碼子使用頻率表，在1209個密碼子中TAT的使用頻率為3，另一Tyr的密碼子TAC的使用頻率為13，顯而易見，以TAC替換TAT，將有利於將酪氨酸殘基加入蛋白質多肽鏈中。同樣，以GCT(Ala密碼子，使用頻率95)替代GCA(45)、GCC(10)、GCG(28)，CTG(Leu，93)→CTT(4)、CTA(0)、CTC(3)等等也都將有利於GRF在大腸桿菌中的表達。現將可能在大腸桿菌中替換的密碼子列於下表。
3 6 9 12 15Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly5′TAT GCA GAT GCC ATC TTC ACC AAC AGC TAC CGG AAG GTG CTG GGCC T C T T A TCT A T TG A G G TCG C A18 21 24 27 30Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg GlnCAG CTG TCC GCC CGC AAG CTG CTC CAG GAC ATC ATG AGC AGG CAGT T A G TC CGTA CGCG33 36 39 42Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg LeuCAG GGA GAG AGC AAC CAA GAG CGA GGA GCA AGG GCA CGG CTT 3′T A TCC G A T T T CGT T T GC C TCG C C C CGC CT T由於GRF的分子量很小(5.3kd)，在大腸桿菌中很容易降解，這也是GRF至今沒有得到純品的原因之一，因此，本發明首先考慮將其連接到一個大蛋白上，聯合表達。目前，這種例子很多，形成商品化的也有，比如葡萄球菌的SPA蛋白，人的碳酸酐酶和穀胱甘肽S-轉移酶，大腸桿菌的β-半乳糖酐酶等等，1993年世界專利9201707提出了一種新的純化方式以融合蛋白形式表達小分子蛋白，特別是以碳酸酐酶為融合蛋白配體，在配體與小分子蛋白之間加入一個蛋白酶特別是腸激酶切點，表達的融合蛋白以親和層析的方式一步純化，但由於本發明使用的表達載體內的啟動子效率很高，表達的蛋白難以迅速摺疊，而以包涵體的形式出現，因此，不需要通過親和層析，僅通過對包涵體的洗滌即可達到80％以上的純度，因此，方法上與該專利有著很大的區別。其次，考慮將其連接到一個能夠將GRF分泌到大腸桿菌胞質間或胞外的信號肽上，由於細胞胞間質和胞外的蛋白酶的含量大大低於細胞內，因此能夠保護GRF不被迅速破壞。這樣的信號肽也比較多，比如stII等，有文獻報導信號肽stII能將約90％的表達產物分泌到胞外。本發明將這種大分子量蛋白配體或通過反向聚合酶鏈式反應(Reverse Transcription Polymerase ChainReaction，RT-PCR)將碳酸酐酶基因從人胎肝中調出來，或通過PCR反應將配體基因從別的質粒上調出來，克隆到pUC19載體上。在分別經序列測定分析驗證後，將GRF基因與配體基因通過連接序列(Linker)頭尾相連，中間的linker為蛋白酶識別序列，比如腸激酶或凝血酶的識別序列，經序列分析鑑定連接正確，不存在移碼突變後，將該融合基因克隆到原核細胞溫度誘導型表達載體如pBV220上，組裝成原核高效表達系統。
該質粒轉化大腸桿菌(E.coli)菌株，獲得重組基因工程菌。質粒pBV220上含PLPR啟動子及溫度突變型的cIts857基因，菌株經28-30℃培養後，40-42℃誘導融合蛋白表達。SDS-PAGE電泳表明當配體蛋白為碳酸酐酶II時，融合蛋白分子量為36.96KD，以包涵體形式存在於大腸桿菌內。融合蛋白佔菌體總蛋白的30％左右。GRF約佔4.3％，配體蛋白為SPA的ZZ功能區時，融合蛋白的分子量為27KD，表達量也約有30％左右，GRF約佔6％。
工程菌發酵及重組GRF的純化。以M9CA為基礎培養基，發酵過程中用葡萄糖作為補料。發酵參數如下溫度30-42℃，溶氧80-100％，pH6.8-7.2。發酵後工程菌經超聲破碎，離心收集包涵體，去離子水洗滌，8mol/L尿素變性，分子篩分離後，1mol/L尿素復性而獲得融合蛋白。融合蛋白經蛋白酶處理後，再通過分子篩分離，得到純化的GRF。若GRF連接在信號肽上，則GRF不是以包涵體形式存在，GRF分泌在胞周間質或胞外，純化則需要通過疏水柱、分子篩和離子交換的方法處理。
本產品的優越性在於首次使用基因工程技術，得到了大量純化的重組人促生長激素釋放因子的基因工程產品，工藝流程簡單，與傳統的生產技術相比，極大地降低了生產成本，可以解決因價格昂貴而無法大量投入臨床使用等問題，為GRF的大規模臨床應用創造了條件。


圖1為「搭橋」法合成GRF基因序列；圖2為質粒pBCG的構建圖譜；圖3為質粒pJZG構建圖譜；圖4為質粒pJSG構建圖譜；圖5為pBCG質粒在大腸桿菌DH5α中的表達，從左到右泳道依次為蛋白分子量標準，pBCG1，pBCG2，pBCG3，pBCG4，pBV220對照。其中，pBCG4的表達量較高，轉化大腸桿菌BL21後，表達量高於30％；圖6為pJZG質粒在大腸桿菌DH5α中的表達，從左到右依次為蛋白分子量標準，pJW2，pJW-CG1，pJW-CG2，pJW-CG3，pJZG1，pJZG2，pJZG3，pJZG4，pJZG5，pJZG6。其中，pJW-CG系列為CG基因連接到pJW2質粒上，因其表達量較低，在後面的工作中放棄了這種表達載體。pJZG6轉化大腸桿菌BL21後，表達量也有所提高；圖7為質粒pJSG在大腸桿菌DH5α中的表達，該圖表現的是兩種濃度的膠，左為雙層膠，下層膠濃度為20％，上層膠為10％，右為15％的單層膠，樣品相同，但左面的膠解析度高於右邊，上樣順序依次為EGF樣品(分子量為6.7KD)，pJSG1-5號樣品，pJW2對照，蛋白分子量標準，分子量標準從小到大依次為14KD，21KD，31KD，40KD，42KD，55KD，66.2KD，97.4KD，由於沒有小分子量的蛋白標準，因此採用表達的EGF為對照。實施例一1、GRF基因全長序列的設計及合成依據Mayo，KE的GRF序列，從新修改後合成的新序列如下本發明使用「搭橋」法，具體方法見圖1，即如合成引物一樣，從兩個方向合成GRF基因的一半，中間十個鹼基互補，這兩段寡核苷酸序列如下序列①5′-GGTTTAAATACGCAGATGCTATTTTCACTAACAGCTACCGTAAAGTACTGGGTCAGCTGTCCGCTCGTAAGCTGCTGCAAGA-3′序列②3′-ACGACGTTCTATAGTACTCGGCAGTCGTCCCACTTTCGTTGGTCCTTGCACCACGTGCACGTGCAGCATTACTCCTAGGAA-5′兩段基因先經過磷酸化反應，條件如下2μlDNA1μl多聚核苷酸激酶(PNK)2μl10xPNK緩衝液1μl4xdATP(10mmol/L)13μl去離子水37℃反應30分鐘，65℃10分鐘，之後，在大片段(Klenow)酶的作用下，兩條鏈分別從5′端向3′端延伸，從而得到GRF基因正反兩條鏈的全序列。反應條件如下2μl5′DNA鏈2μl3′DNA鏈2μl4xdNTP(2.5mmol/L)1μlKlenow酶(3U/μl)3μl10x連接緩衝液10μl去離子水37℃反應4小時，即得到GRF基因全序列。將GRF基因克隆到大腸桿菌pUC19載體上，重組質粒命名為pUG0，經酶切初步鑑定為GRF基因後，進行核酸的序列分析，進一步驗證GRF基因的正確性。2、融合蛋白基因的構建及全序列的測定本發明選擇人II型碳酸酐酶作為融合蛋白的配體，根據Gene Bank上Forsman，C等報導的II型碳酸酐酶結構基因序列，合成5′和3′端引物，5′端引物前加EcoRI位點，即5′-CTATGAATTCATGTCCCATCACTGGGGG-3′(劃線處為EcoRI位點)，3′端引物設計時刪除CAII基因786處HindIII位點之後的兩個密碼子及終止密碼子，加上腸激酶的酶切位點的前五個胺基酸Val-Asp-Asp-Asp-Asp的密碼子GTTGACGACGACGAT及EcoRV位點，形成3′端引物，即5′-GGGGTAAGATATCGTCGTCGTCAACGAAAGCTTTGATTTGCCTGT-3′(劃線處依次為EcoRV、HindIII位點)，使用DNA合成儀合成這兩個引物，純化後準備用於PCR。以人胚肝為材料，提取胚肝總RNA，用RT-PCR的方法擴增CAII基因，CAIImRNA模板的製備材料源於人胚肝，從胚肝組織中提取總RNA，方法按Promega公司提供的產品指南用異硫氰酸胍提取，以此為模板，進行RT-PCR，反應體系如下第一條鏈的合成使用Boehringer公司cDNA合成試劑盒，反應體系為5μlRNA(2-5μg)4μl5x反轉錄酶緩衝液1μlRNasin(50U)2μl4xdNTP(各2.5mmol/L)2μl3′端引物(50pmol)2μlAMV反轉錄酶加無RNase水至20μl。混勻，42℃反應1小時，得到第一條cDNA鏈。
PCR擴增CAII基因5μlcDNA10μl10xTaq酶緩衝液(含MgCl2)1μl5′引物(50pmol)2μl3′引物(50pmol)8μl4xdNTP(各2.5mmol/L)1μlTaq聚合酶(1-2U)加去離子水至100μlPCR反應條件為94℃變性45秒，50℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，35個循環後，取10μl反應混合物以0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察到一條700bp左右的帶，與CAII基因編碼區長度近似，將該反應物作加磷反應後，補平，平端連接到pUC19的SmaI位點，轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆。經酶切鑑定證實，CAII基因343位點為限制酶PstI切割位點，從該點將CAII分成兩個亞克隆，分別測序，確定後，定名為pUCA。將pUG0用DraI和BamHI消化，回收約200bp小片段(GRF片段)，pUCA用EcoRI+EcoRV消化，回收小片段，將兩個片段與羥EcorI+BamHI雙酶切的pUC19質粒用T4DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆，測序確定EcoRV/DraI平端連接處閱讀框架是否正確。該質粒定名為pUCG，CA-GRF全序列如下9 18 27 36 45 545′ATG TCC CAT CAC TGG GGG TAC GGC AAA CAC AAC GGA CCT GAG CAC TGG CAT AAGMet Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp His Lys63 72 81 90 99 108GAC TTC CCC ATT GCC AAG GGA GAG CGC CAG TCC CCT GTT GAC ATC GAC ACT CATAsp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp Ile Asp Thr His117 126 135 144 153 162ACA GCC AAG TAT GAC CCT TCC CTG AAG CCC CTG TCT GTT TCC TAT GAT CAA GCAThr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser Val Ser Tyr Asp Gln Ala171 180 189 198 207 216ACT TCC CTG AGG ATC CTC AAC AAT GGT CAT GCT TTC AAC GTG GAG TTT GAT GACThr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His Ala Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp225 234 243 252 261 270TCT CAG GAC AAA GCA GTG CTC AAG GGA GGA CCC CTG GAT GGC ACT TAC AGA TTGSer Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys Gly Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu279 288 297 306 315 324ATT CAG TTT CAC TTT CAC TGG GGT TCA CTT GAT GGA CAA GGT TCA GAG CAT ACTIle Gln Phe His Phe His Trp Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr333 342 351 360 369 378GTG GAT AAA AAG AAA TAT GCT GCA GAA CTT CAC TTG GTT CAC TGG AAC ACC AAAVal Asp Lys Lys Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys387 396 405 414 423 432TAT GGG GAT TTT GGG AAA GCT GTG CAG CAA CCT GAT GGA CTG GCC GTT CTA GGTTyr Gly Asp Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly441 450 459 468 477 486ATT TTT TTG AAG GTT GGC AGC GCT AAA CCG GGC CTT CAG AAA GTT GTT GAT GTGIle Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val Asp Val495 504 513 522 531 540CTG GAT TCC ATT AAA ACA AAG GGC AAG AGT GCT GAC TTC ACT AAC TTC GAT CCTLeu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr Asn Phe Asp Pro
549 558 567 576 585 594CGT GGC CTC CTT CCT GAA TCC TTG GAT TAC TGG ACC TAC CCA GGC TCA CTG ACCArg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr Tyr Pro Gly Ser Leu Thr603 612 621 630 639 648ACC CCT CCT CTT CTG GAA TGT GTG ACC TGG ATT GTG CTC AAG GAA CCC ATC AGCThr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp Ile Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser657 666 675 684 693 702GTC AGC AGC GAG CAG GTG TTG AAA TTC CGT AAA CTT AAC TTC AAT GGG GAG GGTVal Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys Phe Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly711 720 729 738 747 756GAA CCC GAA GAA CTG ATG GTG GAC AAC TGG CGC CCA GCT CAG CCA CTG AAG AACGlu Pro Glu Glu Leu Met Val Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn765 774 783 792 801 810AGG CAA ATC AAA GCT TTC GTT GAC GAC GAC GAT AAA TAC GCA GAT GCT ATT TTCArg Gln Ile Lys Ala Phe Val Asp Asp Asp Asp Lys Tyr Ala Asp Ala Ile Phe819 828 837 846 855 864ACT AAC AGC TAC CGT AAA GTA CTG GGT CAG CTG TCC GCT CGT AAG CTG CTG CAGThr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln873 882 891 900 909 918GAT ATC ATG AGC CGT CAG CAG GGT GAA AGC AAC CAG GAA CGT GGT GCA CGT GCAAsp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala927CGT CTG TAA 3′Arg Leu ***質粒pUCG的構建見圖2。3、融合蛋白在大腸桿菌中的表達將質粒pUCG1用EcoRI+SalI雙酶消化，回收CAII-GRF片段，將其連接到pBV220同樣位點。pBV220為一種原核表達型質粒，含λ噬菌體PLPR啟動子、CIts857阻抑蛋白基因和5sRNA轉錄終止序列t1t2等調控元件，重組後質粒轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α株系，經酶切鑑定CAII-GRF基因插入後，該質粒命名為pBCG，質粒pBCG的構建見圖2，並轉化E.Coli BL21菌株。
挑含質粒pBCG的單菌落到3ml含100μg/ml氨苄青黴素(Amp)的LB培養基中，30℃振蕩培養過夜，按10％接種量轉種於20mlLB-Amp培養基中，30℃培養至O.D600值達0.4-0.7，升溫至42℃，誘導5小時。取1ml培養液離心，收集菌體，溶於100gl1x蛋白上樣緩衝液50mmol/LTris-cl，pH6.8100mmol/LDTT(或5％ β-ME)2％ SDS0.1％ 溴酚藍10％ 甘油中，取10μl作10％SDS-PAGE電泳，鑑定表達產物，挑選表達量最大的菌株，做為菌種存於甘油管中，定名為PBCG1。
取PBCG1菌種劃單菌落，挑單菌落於6mlLB-Amp培養基中過夜培養，2-5％接種於100ml含100μg/mlAmp的M9CA16.8g/l Na2HPO4·12H2O3.0g/l KH2PO40.5g/l NaCl1.0g/L NH4Cl246mg/L MgSO4·7H2O1.5％ Glucose1.5％ Casamino Acids4mg/L Thiamine-HCl培養基中，搖瓶培養至O.D600達0.4-0.7，升溫至42℃誘導表達3-5小時，離心收集菌體，用超聲裂解液50mmol/L Tris-cl1mmol/L EDTA100mmol/L NaCl洗一次，保存於-20℃或立即用於表達產物的鑑定與純化。4、表達產物鑑定(1)SDS-PAGE凝膠電泳鑑定產物表達量樣品處理和點樣1ml誘導後菌液離心後沉澱懸浮於100μl1x上樣緩衝液，置沸水浴中5分鐘，溶解沉澱；純化的樣品，取相當於1ml菌液的樣品量，沉澱加100μl 1x上樣緩衝液，上清加等體積2x上樣緩衝液100mmol/L Tris-cl，(pH6.8)200mmol/L DTT(或10％β-ME)4％ SDS0.2％ 溴酚藍20％ 甘油上樣量加倍，對照菌或誘導前細菌採取同樣方法處理。
凝膠染色考馬斯亮蘭。
表達水平凝膠中蛋白質的染色條帶用雙波長掃描儀作黑度掃描，計算機處理，列印蛋白CA-G0峰所佔百分比。
結果42℃誘導的PBCG1菌體裂解液在SDS-PAGE膠上分子量相當於36.96KD處有一條深染帶，對照經同樣處理的菌體裂解液在同樣部位帶型極淺，掃描結果表明CA-G0佔菌體總蛋白30％左右。(2)表達產物的免疫印跡(Western Blot)檢測表達產物經SDS-PAGE電泳後，將不經過固定的PAGE膠上蛋白條帶經電轉轉印到硝酸纖維素膜上，用GRF抗體做免疫印跡，證實融合蛋白中帶有GRF蛋白。詳細方法參見《分子克隆》上相應章節。(3)表達產物在菌體內存在狀態菌體超聲裂解後，離心，將含同樣蛋白量的上清與沉澱分別點樣，SDS-PAGE電泳顯示融合蛋白主要存在於包涵體內，上清中也有，但染色很淺，表明CA-G0表達產物大部分形成了包涵體。5、工程菌的發酵LKB-Bromma罐發酵PBCG1單菌落在6mlLB-Amp培養液中，30℃過夜培養，做為一級種子液，供發酵用。
按1∶50比例，將一級種子液接種於300mlM9CA-Amp培養液中，30℃搖16小時，做為二級種子液，供發酵用。
將發酵灌高壓蒸汽滅菌(15P，30分鐘)，冷卻後安放至操作臺上，設定溫度為30℃，pH7.0，溶氧83％，攪拌速度450次/分，各項參數穩定後，1∶10接種二級種子液。
在維持上述參數的條件下發酵，5小時後，將溫度升至42℃繼續誘導8-10小時，自動調節pH6.7-7.2左右，溶氧此時大於100％。6、發酵後的純化將發酵菌液收集，離心，回收的菌體加大量超聲裂解液，超聲破碎，反覆4000rpm離心，收集包涵體，加去離子水反覆洗滌包涵體，最後一次收集包涵體後，加含8mol/L尿素的變性液8mol/L 尿素50mmol/L Tris-cl(pH8.5)1μl/ml β-ME溶解沉澱。將溶解後的包含體過Sephrose CL600分子篩柱。該柱先用變性液(無β-巰基乙醇)平衡過夜，流速100ml/hr，調整包涵體濃度為10-15mg/ml，上樣，用平衡液洗柱，收集每個峰的樣品，用12％SDS-PAGE檢測，純度可達95％，合併含CA-G0的各段溶液，分別用復性液(1)50mmol/L Tris-HCl(pH9.0)1mol/L 尿素復性液(2)、復性液(3)(2、3與1的區別在於50mmol/L的Tris-cl的pH值依次為pH8.5，8.0)透析，最後用無尿素的復性液(3)透析後，回收樣品。7、酶切反應透析後的樣品加至終濃度5-7mmol/LCaCl2，1∶500(W/W)腸激酶，25℃-37℃反應16-20小時，SDS-PAGE電泳檢測酶切狀況。腸激酶的切割效率可達80％以上。
將上述液體仍過分子篩柱，平衡液為50mmol/LTris-cl(pH8.0)，平衡過夜後上樣，洗脫液與平衡液相同，收集各個洗脫峰，用SDS-PAGE檢測，此時GRF的純度可達95％。合併含G0片段的各段溶液，超濾濃縮，至此，GRF總表達量約佔總菌體蛋白量的1％。8、免疫印跡將經過酶切的GRF片段走SDS-PAGE電泳，用免疫印跡法證明切下的蛋白為GRF。9、活性鑑定取大鼠垂體細胞做活性檢測。具體方法如下切下大鼠(～250克)頭部，取出去除中後葉的垂體，逐次放入三個加有培養液的平皿中漂洗，之後，剪碎成約1mm3的小塊，再次將其轉入小方瓶中漂洗，組織塊沉降後，吸出上層培養液，加入酶消化液(2.5mg/ml膠原酶，1mg/ml透明質酸酶，0.4-0.5mg/mlDNA酶I)，輕輕吹打，放入30℃水浴搖床，隔15分鐘輕輕吹打數次，同時監測消化程度，3-5小時後，加入等體積培養基終止消化，1000rpm離心8分鐘，所得細胞或細胞團塊加入適量培養液(DMEM培養基，含10％小牛血清，1％穀氨醯胺)，儘量吹散細胞團，接種於24孔板中。三天後，細胞完全貼壁，換成無血清培養基，即可測活。測活檢測的是GH及cAMP的含量變化，具體方法參照DuPont NEN公司cAMP-RIA-Kit及Boehringer Mannheim公司GH-RIA-Kit說明書。10、N-端胺基酸序列測定將得到的GRF因子用胺基酸序列測定儀鑑定其N-端15個胺基酸序列。實施例二實驗二與一的不同主要在於融合蛋白基因的不同，實驗二構建的是SPA-G0融合蛋白基因。1、pNE載體的構建首先從設計引物，根據Pharmacia產品目錄上的載體pEZZ18基因序列，設計SPA蛋白Z功能區兩邊的引物，5′引物5′-TATTCATATGAAAAAGAAAAACATTTAT-3′(劃線部為NdeI位點)，3′引物5′-GTGTGAATTCGCATTTGCTGCAGGTGTTAC-3′(劃線部為EcoRI位點)，以pEZZ18為模板，PCR反應條件94℃30秒，54℃30秒，72℃45秒，30個循環後PCR產物分別用EcoRI、NdeI雙酶切，低熔點膠回收大片段，並將其連接到載體pET22b(+)的同樣位點，構建成pNE質粒。2、ZZ-G0融合蛋白基因的構建再將CA-G0片段用HindIII消化，補平，再用SalI酶切，回收linker-G0片段，將其連接到經過同樣處理的pNE質粒，以保證閱讀框正確，序列測定驗證兩段基因連接正確後，再用NdeI、BamHI雙酶切，回收ZZ-G0片段，將其連接到pJW2質粒的NdeI和BamHI位點，構建成pJZG表達質粒。構建方法見圖3。該質粒的表達條件與pBV220質粒相同。
餘下的表達與純化均與實施例一相同。實施例三本例主要是構建含有信號肽的GRF基因，信號肽stII來源於本室自建的pJW-stII質粒，合成G0連接到stII上的5′引物5′-GGACGCGTACGCTTACGCAGATGCTATTTTC-3′(劃線處為MluI位點)，3′引物使用pUC19反向測序引物，以pUCG作為模板，PCR反應條件為95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，30個循環，得到的片段用MluI和SalI消化，連接到pJW-stII質粒上同樣位點，即得到表達質粒pJSG，構建方法見圖4，stII-G0基因序列如下9 18 27 36 455′ ATG AAA AAG AAT ATC GCA TTT CTT CTT GCA TCT ATG TTC GTT TTTMet Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe54 63 72 81 90TCT ATT GCT ACA AAC GCG TAC GCT TAC GCA GAT GCT ATT TTC ACTSer Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr99 108 117 126 135AAC AGC TAC CTG AAA GTA CTG GGT CAG CTG TCC GCT CGT AAG CTGAsn Ser Tyr Leu Lys Val Leu Gly Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu144 153 162 171 180CTG CAA GAT ATC ATG AGC CGT CAG CAG GGT GAA AGC AAC CAG GAALeu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu
189 198CGT GGT GCA CGT GCA CGT CTG TAA 3′Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu ***表達質粒轉化E.coliDH5α，表達條件與pBV220相同，但表達產物經SDS-PAGE電泳表明在胞間質及胞外即培養液中，胞間質的提取方法如下誘導後的培養物離心，上清即為胞外液，可直接用於純化，取沉澱加1/2體積預冷的高滲液20％蔗糖；30mMTris-Cl(pH8.0)；1mMEDTA(pH8.0)懸浮，冰浴15分鐘，12,000離心10分鐘，棄上清，用適量低滲液懸浮，冰浴15分鐘，12000離心10分鐘，取上清，即為胞間質。表達量約為1％。
胞間質或培養液中GRF的純化主要是首先過疏水柱，再過離子交換柱，最後過分子篩柱，純化後純度可達90％。鑑定方法與實施例一相同。
權利要求
1.一種製備重組人促生長激素釋放因子的方法其特徵在於用遺傳工程的方法合成編碼GRF蛋白的結構基因和以融合蛋白的形式在微生物中表達的GRF基因。
2.按照權利要求1所述的方法其特徵在於編碼GRF蛋白的結構基因如下10 20 30 40 50 60TTTAAATACG CAGATGCTAT TTTCACTAAC AGCTACCTGA AAGTACTGGG TCAGCTGTCCAAATTTATGC GTCTACGATA AAAGTGATTG TCGATGGTCT TTCATGACCC AGTCGACAGG70 80 90100110120GCTCGTAAGC TGCTGCAAGA TATCATGAGC CGTCAGCAGG GTGAAAGCAA CCAGGAACGTCGAGCATTCG ACGACGTTCT ATAGTACTCG GCAGTCGTCC CACTTTCGTT GGTCCTTGCA130140150GGTGCACGTG CACGTCTGTA ATGAGGATCCCCACGTGCAG CTGCAGACAT TACTCCTAGG
3.按照權利要求2所述的編碼GRF蛋白的結構基因其特徵在於其結構基因兩端有限制酶識別位點。
4.按照權利要求2所述的編碼GRF蛋白的結構基因其特徵在於其基因序列5′一端限制酶位點為DraI識別位上。
5.按照權利要求1所述的方法其特徵在於以融合蛋白形式表達的GRF基因為其結構基因和配體基因。
6.按照權利要求5所述的GRF基因其特徵在於配體基因為碳酸酐酶。
7.按照權利要求1所述的方法其特徵在於以融合蛋白形式表達的GRF基因，其5′端加上一個linker連結配體蛋白基因，其中，linker為一種蛋白酶的識別位點。
8.按照權利要求7所述的蛋白酶其特徵在於所用的蛋白酶為腸激酶，其識別位點為-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-。
9.按照權利要求1所述的方法其特徵在於以融合蛋白形式表達的GRF基因配體基因與結構基因間的linker 3′端的限制識別位點為EcoRV識別位點。
10.按照權利要求1所述的方法其特徵在於以融合蛋白形式表達的GRF基因的5′端加上一段大腸桿菌信號肽基因。
11.按照權利要求9所述的方法其特徵在於信號肽基因為stII。
12.按照權利要求10所述的方法其特徵在於與信號肽stII連接的GRF基因5′端的限制酶識別位點為MluI識別位點。
13.按照權利要求9所述的方法其特徵在於與信號肽stII連接的GRF結構基因如下10 20 30 40 50 60ACGCTGACGC TTACGCAGAT GCCTATTTTC ACTAACAGCT ACCTGAAAGT ACTGGGTCAGTGCGACTGCG AATGCGTCTA CGCATAAAAG TGATTGTCGA TGGACTTTCA TGACCCAGTC70 80 90100110120CTGTCCGCTC GTAAGCTGCT GCAAGATATC ATGAGCCGTC AGCAGGGTGA AAGCAACCAGGACAGGCGAG CATTCGACGA CGTTCTATAG TACTCGGCAG TCGTCCCAGT TTCGTTGGTC130140150GAACGTGGTG CACGTGCACG TCTGTAATGA GGATCCCTTGCACCAC GTGCACGTGC AGACATTACT CCTAGG
14.按照權利要求1所述的方法其特徵在於將融合蛋白基因克隆到原核溫度誘導表達載體上，組裝成表達質粒。
15.按照權利要求1所述的方法其特徵在於將融合蛋白基因克隆到表達載體pBV220上。
16.按照權利要求1所述的方法其特徵在於將融合蛋白基因克隆到表達載體pJW2上。
17.按照權利要求1所述的方法其特徵在於重組質粒在大腸桿菌中表達。
18.按照權利要求1所述的方法其特徵在於工程菌的發酵條件為溫 度28-42℃溶 氧80-100％pH6.8-7.2
19.按照權利要求1所述的方法其特徵在於工程菌的最佳發酵條件為生長溫度 30℃誘導溫度 42℃溶氧 83％pH7.0
全文摘要
本發明通過基因重組技術製備人促生長激素釋放因子。採用「搭橋」的方法合成基因雙鏈DNA,並且用融合蛋白的方法表達GRF基因,使其適合於在大腸桿菌中表達。使用該方法以簡單程序、低成本獲得高純度、高活性的GRF蛋白。
文檔編號C12N15/64GK1201831SQ97104450
公開日1998年12月16日 申請日期1997年6月5日 優先權日1997年6月5日
發明者葉寅, 高彤, 田波 申請人:中國科學院微生物研究所