一組用於大腸桿菌多重耐藥基因檢測的液相晶片引物和探針的製作方法
2023-05-28 08:19:06 2
本發明涉及一組用於大腸桿菌多重耐藥基因檢測的液相晶片引物和探針，屬於生物檢測
技術領域：
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背景技術：
：2010年，隨著「超級細菌」這一名詞頻繁地見諸報端，細菌多重耐藥、抗生素的合理使用重返人們視線。超級細菌其實並非新事物，它不是一個細菌的名稱，而是一類細菌的名稱，這一類細菌的共性是對幾乎所有的抗生素都有強勁的耐藥性，它們一直存在並且隨著人類濫用抗生素而進化出強大耐藥性。細菌耐藥性，尤其是多重耐藥性(multidrugresistance,mdr)已經成為非常嚴重的醫療問題及社會問題。細菌耐藥機理十分複雜，在抗生素的壓力選擇下，臨床細菌耐藥狀況的日益惡化。細菌耐藥性的檢測與監測對於正確的目標性抗感染治療以及監測細菌耐藥性變遷和耐藥菌感染的流行病學調查，制定防控細菌耐藥性增加的措施至關重要。然而，目前臨床實驗室多採用耐藥表型的檢測方法，其檢測周期長時效性差、檢測通量低、影響因素多是最主要的問題，不能滿足目前臨床抗感染治療和醫院感染控制的要求。液相晶片(又稱流式螢光技術、液態晶片、懸浮陣列等)是在後基因組時代發展起來的新一代標準化開放式高通量技術平臺，它有機地整合了編碼微球、雷射技術、應用流體學、最新的高速數位訊號處理器和計算機運算法則，具有高通量、高速度、低成本、靈敏度高、重複性好、線性範圍廣等優點，可廣泛應用於免疫分析、核酸研究、酶學分析、受體和配體識別分析等研究，也是目前唯一得到權威機構和醫學界共同認可用於臨床診斷的生物晶片平臺。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是：利用液相晶片技術，提供一組使大腸桿菌的7種耐藥基因的pcr產物能在一個雜交條件下完成特異性雜交的引物組和探針。本發明提供的一組用於大腸桿菌多重耐藥基因檢測的液相晶片引物，所述7個耐藥基因的引物序列為：一組用於大腸桿菌多重耐藥基因檢測的液相晶片探針，所述7個耐藥基因的探針序列為：耐藥基因探針序列temte-pf:nh2-ttttttttaatcgtgacgggcaaatagctxct-pr:nh2-tttttttttacgtcctttccaatgaaagcshvsh-pf1:nh2-ttttttttttacgtcccgtctggatagcoxa1ox-pf:nh2-tttttttctgcgagggaatcttattagttampcam-pf1:nh2-ttttttgagggaatctttcttgataagyragy-pf3:nh2-tttttttgcgggattcaagcgttcaaaac3aac3-pf3:nh2-ttttttaacgaagtggatcgttaac本發明的有益效果：本發明提供的是一個引物和探針的組合，這7組引物和探針之間無交叉反應，形成一個多重引物組合，不能將其單獨分開。所述的引物和探針組合用於液相晶片，可以同時檢測大腸桿菌多重耐藥基因。具體實施方式實施例1一組用於大腸桿菌多重耐藥基因檢測的液相晶片引物，所述7個耐藥基因的引物序列為：一組用於大腸桿菌多重耐藥基因檢測的液相晶片探針，所述7個耐藥基因的探針序列為：耐藥基因探針序列temte-pf:nh2-ttttttttaatcgtgacgggcaaatagctxct-pr:nh2-tttttttttacgtcctttccaatgaaagcshvsh-pf1:nh2-ttttttttttacgtcccgtctggatagcoxa1ox-pf:nh2-tttttttctgcgagggaatcttattagttampcam-pf1:nh2-ttttttgagggaatctttcttgataagyragy-pf3:nh2-tttttttgcgggattcaagcgttcaaaac3aac3-pf3:nh2-ttttttaacgaagtggatcgttaac實施例2特異性驗證：1.分別取tem、ctx、shv、oxa1、ampc、gyra、aac3耐藥的大腸桿菌培養液，提取dna。利用上述的引物配製多重pcr反應體系(40ul)：2.配製的反應體系按下述程序擴增：a)第一階段：95℃，10min，1個循環。b)第二階段：95℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec；40個循環。c)第三階段：72℃，10分鐘,1個循環。3.擴增後的pcr產物利用液相晶片分析系統進行分析，步驟如下：a.根據pcr反應的管數，用剪刀剪取相應大小的微孔雜交板。打開液相晶片分析系統預熱，並將儀器上微孔板適配銅板的溫度設定在48℃。b.將微球雜交液試劑瓶置於渦旋儀上振蕩30秒，使微球充分混懸在溶液中。並在每一個雜交孔中加入22μl；c.每個樣本吸取pcr擴增產物3μl，並依次加入到相應的上述雜交孔中，並抽吸幾次加以混勻；d.剪取相應大小的封板紙，將微孔雜交板覆蓋封口。請用指壓封口數次，確保封嚴，以防在高溫變性和雜交時溶液蒸發；e.將雜交板置於金屬恆溫浴(可以用pcr儀代替)，把儀器的蓋子壓緊已封口的雜交板，以防封板膜在加熱後張開，導致液體蒸發。變性和雜交過程運行如下程序：95℃5分鐘變性48℃30分鐘雜交f.小心將封板紙撕下，每孔加入螢光素sa-pe75μl，並抽吸幾次加以混勻。加完後將封板紙重新粘好，繼續在48℃下孵育15分鐘；g.將微孔雜交板快速轉移至預熱好的液相晶片分析系統上進行閱讀，得到檢測結果。4.tem、ctx、shv、oxa1、ampc、gyra、aac3耐藥大腸桿菌雜交檢測結果如下表，結果表明設計的引物和檢測探針具有良好的特異性。實施例3靈敏度驗證分別取tem、ctx、shv、oxa1、ampc、gyra、aac3耐藥的大腸桿菌培養液，菌落計數後，統一稀釋到1000/ml,然後梯度稀釋並提取dna，按實施例2中的步驟進行檢測分析，結果如下表，表明設計的引物和檢測探針均能檢出125/ml的菌。sequencelisting一組用於大腸桿菌多重耐藥基因檢測的液相晶片引物和探針21patentinversion3.3120dna人工序列1atgagtattcaacatttccg20217dna人工序列2ttactgtcatgccatcc17327dna人工序列3ttttttttaatcgtgacgggcaaatag27421dna人工序列4gtgacaaagagagtgcaagcc21521dna人工序列5atgattctcgccgctgaagcc21629dna人工序列6tttttttttacgtcctttccaatgaaagc29723dna人工序列7gccgggttattcttatttgtcgc23824dna人工序列8tctttccgatgccgccgccagtca24928dna人工序列9ttttttttttacgtcccgtctggatagc281015dna人工序列10ccaaagacgtggatg151120dna人工序列11gttaaattcgaccccaagtt201229dna人工序列12tttttttctgcgagggaatcttattagtt291318dna人工序列13gatcgttctgccgctgtg181420dna人工序列14gggcagcaaatgtggagcaa201526dna人工序列15ttttttgagggaatctttcttgataa261620dna人工序列16acgtactaggcaatgactgg201721dna人工序列17agaagtcgccgtcgatagaac211826dna人工序列18tttttttgcgggattcaagcgttcaa261918dna人工序列19gttacaccggaccttgga182018dna人工序列20aacggcattgagcgtcag182125dna人工序列21ttttttaacgaagtggatcgttaac25當前第1頁12