測定血清游離肉鹼的試劑的製作方法

2023-06-22 10:32:56 1

專利名稱：：測定血清游離肉鹼的試劑的製作方法
技術領域：
：本發明涉及定量檢測游離肉鹼(FREECARNITINE,簡稱FCar)的方法，更具體講，涉及定量檢測人血漿或血清中FCar含量的試劑。
背景技術：
：肉鹼是介導脂肪酸通過線粒體膜進入線粒體進行P—氧化產生供肌肉和其它細胞代謝所需能量的重要的輔因子。它是一種人體中天然存在的類維生素營養物質。其主要功能是轉運脂肪進入線粒體，促進脂肪酸燃燒，為機體提供能量。通常情況下，肉鹼缺乏會導致骨骼肌和心肌紊亂，因為這兩種肌肉都是高能耗的組織。檢測肉鹼的含量可以對於和此組織相關的疾病進行診斷和治療支持。此外腎病和透析病人的肉鹼會出現代謝紊亂情況，對肉鹼進行監測可以對臨床措施的採取提供支持，此外，一些關於肉鹼的臨床意義還在發現中。目前已報導的測定方法有高效液相(HPLC)法和質譜(MS)法等，多數敏感度不夠。有的需要使用放射性同位素，易造成放射性汙染。有的方法複雜，需時較長，不能適應臨床常規使用。
發明內容本發明的目的是提供一種測定血清游離肉鹼的試劑，以克服現有技術存在的缺陷。技術原理樣本中的肉鹼在(3—硫煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD+)氧化型存在下被肉鹼脫氫酶(CDH)特異性的氧化成脫氫肉鹼，同時卩一硫煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NAD+)氧化型轉化成在卩—硫煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NADH)還原型。而脫氫肉鹼在(3—煙醯胺腺嘌呤二核苷酸還原型(NADH)存在下被肉鹼脫氫酶(CDH)特異性的還原成肉鹼，同時(3—煙醯胺腺嘌呤二核苷酸還原型(NADH)也轉化成(3—煙醯胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(NAD+)。如此肉鹼和脫氫肉鹼在Thio-NAD+和NADH的存在下通過CDH進行酶循環反應導致Thio-NADH的不斷累積，達到平衡後，Thio-NADH的生成量和樣本中的肉鹼的濃度呈一定比例，從而可以通過測定Thio-NADH的生成速度進行標本的游離肉鹼定量。並且，Thio-NAD+和NADH可參與上述循環反應直到枯竭狀態，靈敏度非常高。本發明的試劑，包括如下含量的組分的緩衝溶液Thio-NAD十(硫代輔酶)0.001g/L~10g/LNADH(還原輔酶1)0.01g/L~10g/L肉鹼脫氫酶(CDH)0.5KU/L500KU/L所說的緩衝溶液沒有特別限制，可以是Tris、磷酸鹽或GOOD'S等常規緩衝劑，溶液的pH值為49;優選的，所說的試劑還可以包含緩衝劑、防腐劑、螯合劑、穩定劑、表面活性劑或蛋白酶抑制劑等；所說的防腐劑選自疊氮鈉、硫柳汞、慶大黴素、氯黴素等抗生素或是常見的陽離子類表面活性劑，如十六垸基三甲基溴化氨或十四垸基三甲基溴化氨；；所說的穩定劑可以選擇牛血清白蛋白(BSA)、甘油、胺基酸、金屬離子、螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、表面活性劑或蛋白酶抑制劑等，濃度沒有特別限制，只要不影響正常的反應測定即可，優選的濃度為0.15g/L;優選的，本發明的試劑可以是雙試劑，即該試劑分為試劑(Rl)和試劑(R2)，也可以將所有組分配在一起形成單試劑，也可以配成2個以上的部分形成多試劑，但以雙試劑方式為佳；所說的雙試劑中，試劑(Rl)的組分為和含量為Thio-NAD+(硫代輔酶)0.001g/L10g/L;NADH(還原輔酶l)0.01g/L10g/L;溶液的pH值為4-7試劑(R2)的組分為和含量為肉鹼脫氫酶(CDH)0.5KU/L-500KU/L溶液的pH值為8-9;試劑可以是液體試劑，或為凍幹試劑，使用前用水或一定的緩衝液溶解後再使用。本發明的試劑可以採用常規的物理混合的方法方法進行製備，凍幹試劑也可以採用常規的方法，將上述配比的液體製劑，進行凍幹後，獲得產口口口5本發明的試劑，可以用於定量檢測人血漿或血清中FCar含量。本發明的試劑，配製簡單、快捷、不需特殊儀器，在臨床實驗室常見的全自動或半自動生化分析儀上即可完成操作，整個過程只需10分鐘，大大節省了人力和物力，同時使臨床對大量標本進行測定成為可能。本發明的用於測定游離肉鹼的酶循環反應試劑，具有較高的穩定性，可以廣泛應用在臨床體外診斷上，並降低試劑的浪費。圖1為本法和HPLC法的對比圖2為利用本方法測定的試劑線性。具體實施例方式實施例l按照下列配方配製試劑:tableseeoriginaldocumentpage7配製完成後進行檢測，達到了設定的準確度、精密度和線性的要求，考慮到試劑儲存的穩定性和其中肉鹼脫氫酶、NADH在溶液狀態下不穩定，把該產品做成雙試劑產品，Rl和R2試劑的體積比例為2:1，具體成份分配和配製方法如下試劑Rl:Tris緩衝液12g/LThio-NAD十lg/LBSAlg/LNaN30.5g/L試劑R2:Tris緩衝液12g/LBSAlg/LNaN30.2g/LR2-B乾粉CDH300KU/1NADH6g/L對Rl和R2試劑的成份進行分配以後，先按照液體雙試劑的方式進行了游離肉鹼試劑配製，即把R2—B中CDH和NADH按照設定濃度加入R2一A溶解液中，即獲得產品。或採用如下的方法進行凍幹，製備凍幹製劑先將溶液從25t:冷卻到一40。C，這個冷卻維持四個小時，保證瓶內的溶液溫度均勻，然後在一定的真空度下(20pa的壓強下)進行緩慢升溫到25°C，這個過程需要3—4個小時，然後在25'C下和20pa的壓強的真空度下進行乾燥，這個過程完全由真空凍幹機來控制，約需要37個小時。等凍幹品的溫度和凍幹機乾燥室的溫度一致時，表示凍幹品已經達到充分乾燥狀態，乾燥過程結束，最後在玻璃瓶內衝入氮氣，蓋上塞子，完成整個2-B的凍幹。獲得凍幹製劑。實施例2應用實施例設備日立7170型自動生化分析儀根據游離肉鹼檢測試劑的反應原理，考慮到試劑靈敏度和吸樣比例之間的影響關係和目前全自動生化分析儀反應池容量的要求和限制，採用樣本:試劑l:試齊U2二12PL:200UL:100nL的比例來試驗。首先採用紫外可見分光光度計在405nm波長下和37"C孵育下，對一定濃度的游離肉鹼和配製的游離肉鹼單試劑按照反應比例混合後進行吸光度變化掃描，發現游離肉鹼和游離肉鹼檢測試劑混合後有非常明顯的吸光度上升趨勢，其斜率固定，見下圖1。考慮到雙試劑混合後的酸度和溫度的緩衝時間，因此在日立自動生化分析儀上選取了第六分鐘到第十分鐘的吸光度變化來檢測游離肉鹼的含量。下面是確定的反應體系參數。樣本採集及用量人血清，用量血清12pL。試劑用量Rl200jiL，R2100pL。反應條件血清12pL，和R1試劑混勻後,37'C孵育5分鐘後，加入試劑R2混勻後孵育一分鐘，然後採用405nm波長開始測定，連續測定4分鐘，每隔一分鐘測定一次。求吸光度變化值(AA/min)。校準方法用市售肉鹼配製濃度為5(^rnol/L的溶液作為標準品。上述試劑測定新鮮的病人血清中的FCar的含量，在日立7170全自動生化分析儀進行檢測，HPLC法作為對照，結果如圖h圖l中，曲線l代表理論曲線，曲線2代表測定結果的回歸曲線，縱坐標為本發明的測定結果，橫坐標為HPLC測定結果，計量單位為"mol/L;統計y=0.961x+1.33測定例數=20相關係數F0.990由此可見，採用本發明的酶循環法測定游離肉鹼和HPLC具有良好的相關性。用市售肉鹼配製最高值為200)imol/L的線性標準品，用上述試劑測定結果如下線性標準液pmol/L測定結果pmol/L0.00.140.042.180.081.2120.0121.6160.0159.1200.0192.3圖2中，縱坐標為本發明的線性標準液的濃度，橫坐標為採用本法測得的濃度，計量單位為Umol/L;其中r2=0.9997由此可見，採用本發明的試劑，酶循環法測定游離肉鹼可以達到測定上限為200jamol/L。實施例3按照下列配方配製試劑組分濃度JWMES緩衝液21g/LThio-NAD+lg/LBSAlg/Ltableseeoriginaldocumentpage11統計y=0.986x+0.08測定例數=20相關係數F0.990。1權利要求1.測定血清游離肉鹼的試劑，其特徵在於，該試劑為包括如下含量的組分的緩衝溶液Thio-NAD+(硫代輔酶)0.001g/L～10g/LNADH(還原輔酶1)0.01g/L～10g/L肉鹼脫氫酶(CDH)0.5KU/L～500KU/L。2.根據權利要求1所述的試劑，其特徵在於，所說的緩衝溶液是Tris、磷酸鹽或GOOD'S,溶液的pH值為4-9。3.根據權利要求1所述的試劑，其特徵在於，所說的試劑還包含防腐劑、螯合劑、穩定劑、表面活性劑或蛋白酶抑制劑。4.根據權利要求3所述的試劑，其特徵在於，所說的防腐劑選自疊氮鈉、硫柳汞、慶大黴素、氯黴素等抗生素或是常見的陽離子類表面活性劑。5.根據權利要求3所述的試劑，其特徵在於，所說的穩定劑選自白蛋白、甘油、胺基酸、金屬離子、螯合劑、表面活性劑或蛋白酶抑制劑。6.根據權利要求5所述的試劑，其特徵在於，金屬離子為Mg2+，螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)、表面活性劑為Tritonx-100或吐溫類，蛋白酶抑制劑為蛋白酶抑制劑PMSF(對甲基磺醯氟)、抑肽酶、植酸、硼酸鹽。7.根據權利要求l所述的試劑，其特徵在於，所說的試劑是由試劑(R1)和試劑(R2)組成的雙試劑。8.根據權利要求7所述的試劑，其特徵在於，所說的雙試劑中，試劑(Rl)的組分為和含量為Thio-NAD+(硫代輔酶)0.001g/L~10g/L;NADH(還原輔酶l)0.01g/L~10g/L;溶液的pH值為4-7;試劑(R2)的組分為和含量為-肉鹼脫氫酶(CDH)0.5KU/L~500KU/L溶液的pH值為8-9。9.根據權利要求l所述的試劑，其特徵在於，試劑為凍幹試劑。全文摘要本發明提供了一種測定血清游離肉鹼的試劑，該試劑為包括如下含量的組分的緩衝溶液硫代輔酶0.001g/L～10g/L，還原輔酶10.01g/L～10g/L，肉鹼脫氫酶0.5KU/L～500KU/L。本發明的用於測定游離肉鹼的酶循環反應試劑，具有較高的穩定性，可以廣泛應用在臨床體外診斷上，並降低試劑的浪費。文檔編號G01N33/50GK101514984SQ200810033819公開日2009年8月26日申請日期2008年2月22日優先權日2008年2月22日發明者崔鵬飛,張映新申請人:上海藍怡科技有限公司