紅花總黃色素及其製備方法和應用的製作方法

2023-06-05 06:09:31 1

專利名稱：紅花總黃色素及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及從活血化淤中藥紅花中製備的一種總成分及其製備方法，此總成分的新用途及其組成的物及保健品組合物。
中藥紅花為菊科植物Carthamus tinctorius L.的乾燥花，為一常用的活血化淤藥，可用於冠心病，心絞痛等諸多血液循環障礙疾病的治療。臨床上紅花以水煎液入藥，紅花黃色素為紅花的主要水溶性成分，為一混合查耳酮甙[參見.高其銘，中藥紅花的藥理研究概況，中西醫結合雜誌，1984，4(12)758-760.]紅花總黃色素粗品為一國家允許使用的食品色素(GB2760-86)[參見周立國，食用天然色素及其提取應用。158-160.濟南，山東科學技術出版社.]，研究表明，它具多方面的心血管藥理作用，可抗凝，促進纖溶，抗血栓形成，改善微循環等[參見.高其銘，中藥紅花的藥理研究概況，中西醫結合雜誌，1984，4(12)758-760.]。此粗品紅花總黃色素的製備方法為水提醇沉法，因其未經層析等方法除雜質，其薄層圖譜為一從原點到前沿的拖尾色帶[參見天津醫藥工業研究所等，紅花的研究(二)紅花黃色素及其分離物的藥理研究。山西醫藥雜誌。19809(1)2-8]，提示其純度較低。紅花總黃色素目前僅有水提醇沉法製得的粗品作為食品色素生產，尚無紅花總黃色素藥品或保健品製劑。
本發明提供了一種紅花總黃色素，該紅花總黃色素可用下述方法製得以紅花為原料，加入適量的極性溶劑浸提，濾除藥渣合併浸提液，濃縮得到濃縮液；把經上述步驟得到的濃縮液進行柱層析，以水洗脫除去雜質；或以層析擔體吸附雜質，再以極性洗脫液洗脫紅花總黃色素，收集洗脫液，回收溶劑，濃縮乾燥即得。
本發明還提供了一種紅花總黃色素的製備方法，該方法包括下述步驟以紅花為原料，加入適量的極性溶劑浸提，濾除藥渣合併浸提液，濃縮得到提取濃縮液；把上述步驟得到的提取濃縮液進行柱層析，以水洗脫除去雜質；或以層析擔體吸附雜質，再以極性洗脫液洗脫紅花總黃色素，收集洗脫液，回收溶劑，濃縮乾燥即得。
在本發明的製備方法的一個優選實施方案中，所述的提取是以極性溶劑提取2-4次，每次1-3天，提取用極性溶劑用量為紅花生藥量的5-50倍。
在本發明的製備方法的另一優選實施方案中，所述的進行除雜質的紅花提取濃縮液濃度相當於0.5-10克生藥/毫升。
在本發明的製備方法的另一優選實施方案中，所述的柱層析除雜質方法為以聚醯胺柱層析法去除紅花提取濃縮液中的雜質，且其紅花提取濃縮液與所用聚醯胺粉之比按體積計為1∶1-30。
在本發明的製備方法的另一優選實施方案中，所述的柱層析擔體除雜質方法是以矽膠吸附紅花提取濃縮液中的雜質，且其紅花提取濃縮液與所用矽膠粉之比按體積計為1∶1-30。
在本發明的製備方法的另一優選實施方案中，所述的用以洗脫紅花總黃色素的極性洗脫液為水或者濃度為20-95重量百分比的乙醇，甲醇或丙醇水溶液。
在本發明的製備方法的另一優選實施方案中，所述的用以洗脫紅花總黃色素的極性洗脫液為水或者濃度為40-95重量百分比的乙醇，甲醇或丙醇水溶液。
本發明提供了一種紅花總黃色素在製備預防及治療血小板激活因子與自由基所致損傷疾病的藥物中的應用。
本發明提供了一種紅花總黃色素在製備預防及治療血小板激活因子與自由基所致損傷疾病的保健品中的應用。
本發明提供了一種治療及預防心腦血管疾病的藥物，其中含有治療心腦血管疾病有效量的紅花總黃色素和可藥用的載體。
本發明提供了一種治療及預防心腦血管疾病的保健品，其中含有治療心腦血管疾病有效量的紅花總黃色素和可藥用的載體。
本發明用於製備治療及預防具血小板激活因子及自由基損傷的血液循環障礙性疾病特別是心肌缺血性疾病的藥物及保健品組合物。此組合物含活性成分紅花總黃色素及藥物可接受的賦形劑，載體或稀釋劑，以常規方法將其製成藥物或保健品製劑。
製備該組合物時，可將紅花總黃色素與載體混合或用載體包埋，此載體可以是膠囊或其他裝載形式。載體可為固體，半固體或液體物質，它作為紅花總黃色素的載體，賦形劑或介質。該組合物可以是片劑，丸劑，栓劑，粉末，醑劑，懸浮液，乳濁液，溶液，糖漿，注射劑等多種形式。
多種載體，賦形劑或稀釋劑可用於本組合物。如乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，澱粉，聚乙二醇，明膠等。該製劑中還可加入潤滑劑，溼潤劑，矯味劑，懸浮劑，防腐劑等。本發明的組合物可使用本領域通常採用的任何方法製備，以達到對患者使用後，活性成分發揮最大藥效的目的。
此藥物及保健品組合物可經口服，靜脈注射，肌肉注射，經皮或皮下注射給藥，經直腸給藥等。可單次或多次連續使用，而藥物組合物使用劑量則應根據病人的具體情況決定，一般應控制在0.001-0.5克紅花總黃色素/公斤體重·天。
本發明採取水提，聚醯胺柱層析洗脫法或矽膠吸附法除雜質後製得一純度較高的紅花總黃色素，這些方法在紅花成分提取製備的過程中的應用尚未見報導它們可有效地除去胺基酸及糖類雜質，明顯提高紅花總黃色素的純度，本發明的方法製備所得的紅花總黃色素均無胺基酸及游離糖反應，其薄層圖譜均可見6-8個輪廓清晰的螢光斑點，而水提醇沉法所得的粗品在同樣條件下薄層螢光圖譜則為一拖尾嚴重的色帶，其上僅見2-3個輪廓模糊的斑點(見說明書附圖
)，提示本發明的紅花總黃色素純度較水提醇沉法獲得的粗品為高。且此法操作簡便，易於掌握，可作為紅花總黃色素製備及紅花水溶性成分的初步淨化方法。據報導紅花黃色素具抗凝，促進纖溶，抗血栓形成，改善微循環等心血管藥理作用，但紅花黃色素的清除自由基及抗血小板激活因子的作用尚未見報導，因此它可用於諸多具自由基及血小板激活因子損傷的血液循環障礙疾病的治療及預防，特別可用於心絞痛，心肌梗塞等心肌缺血性疾患的治療及預防。
紅花總黃色素的下述藥效尚未見報導(1)紅花總黃色素抑制血小板激活因子誘發的血小板聚集的作用動物紐西蘭家兔，體重3-4公斤，雌雄不限。儀器Chronolog型血小板聚集儀，血小板激活因子(PAF)為Sigma公司產品，其他試劑均為國產分析純。紅花總黃色素為實施例1方法製得。取家兔耳正中動脈血10毫升(檸檬酸鈉-檸檬酸-葡萄糖溶液∶全血＝1∶6抗凝)，500轉/分離心5分鐘，得富血小板血漿，2000轉/分離心5分鐘得血小板，以pH6.5的無鈣臺氏液洗滌兩次，每次洗後2000轉/分離心5分鐘，棄上清，加pH7.4含0.25％牛血清白蛋白50mM三羥甲基氨基甲烷-臺氏液(TTBSA)調整血小板濃度至2×108/毫升，即為家兔洗滌血小板懸液(WRP)。取0.18毫升WRP，37度(本文所提及的溫標均為攝氏溫標)預熱後加入0.01毫升紅花總黃色素溶液，加0.01毫升血小板激活因子後以比濁法記錄血小板聚集曲線。空白對照管以蒸餾水代替紅花總黃色素溶液。以紅花總黃色素管血小板聚集率與空白管血小板聚集率比較，計算血小板聚集抑制率衡量其藥效。
結果PAF濃度 紅花總黃色素濃度(g/L) 血小板聚集抑制率(％)2nM 0.0 0.00.21 28.00.42 32.90.85 60.01.69 79.4結果表明，紅花總黃色素抑制血小板激活因子誘發的家兔洗滌血小板聚集具明顯的量效關係。其它實施例方法製得的紅花總黃色素依本法實驗所得數據與上述結果趨勢相同。
(2)紅花總黃色素抑制血小板激活因子誘發的血小板釋放5-羥色胺(5-TH)的作用以上法製得的WRP，取0.8毫升WRP，加入紅花總黃色素(實施例1方法製得)溶液，37℃預熱2分鐘後加10微升血小板激活因子37℃反應4分鐘2000轉/分離心10分鐘，取上清液0.3毫升加TTBSA0.7毫升，再加0.3毫升100％三氯醋酸3500轉/分離心20分鐘，取0.5毫升上清液，加2毫升0.05％鄰苯二甲醛/HCl溶液，100℃水浴加熱10分鐘，水冷後加2毫升氯仿混勻後3500轉/分離心20分鐘，取上清1毫升測定5-TH螢光(Ex360nm，Em475nm)。陰性對照管以蒸餾水代替紅花總黃色素溶液，以同濃度紅花總黃色素TTBSA稀釋液代替WRP管為試劑空白。各反應管測定值均扣除試劑空白值測得5-TH螢光值F(Ex360nm，Em475nm)。
結果PAF 紅花總黃色素濃度(g/L) F(Ex360nm，Em475nm)2nM0 354.70.103 329.60.207 309.00.414 263.80.828 234.6結果表明，紅花總黃色素抑制血小板激活因子導致的5-TH釋放具明顯的量效關係。其它實施例方法製得的紅花總黃色素依本法實驗所得數據與上述結果趨勢相同。
(3)紅花總黃色素抑制血小板激活因子誘發的小鼠毛細血管通透性增加的作用動物為昆明種小鼠，雌雄不限，體重20-40克，隨機分組，小鼠腹腔注射紅花總黃色素(實施例1方法製得)溶液後30分鐘；尾靜脈注射3％依文斯藍生理鹽水溶液2毫升/公斤，尾靜脈注射後30分鐘於小鼠一側後腿股四頭肌注射PAF0.25％牛血清白蛋白生理鹽水溶液以造成局部炎症反應，於同一動物另一側後腿股四頭肌注射同體積生理鹽水，注射後30分鐘處死動物，分別取兩後腿肌肉剪碎，每隻後腿肌肉碎塊中加入2毫升甲醯胺，56℃提取24小時，3000轉/分離心20分鐘後取上清液，於620nm以每隻動物生理鹽水側後腿提取液為空白，測定對側後腿提取液吸光度，以此數據衡量小鼠毛細血管通透性的改變。無損傷空白對照組以生理鹽水代替PAF，生理鹽水代替紅花總黃色素溶液為陰性空白。
結果對照組PAF組 低劑量組 中劑量組次高劑量組 高劑量組PAF劑量 - 191nM50μL 同左 同左同左 同左黃素劑量- - 0.08g/kg 0.16g/kg0.32g/kg 0.48g/kgn 12 22 10 8 12 6A6200.076 0.442 0.396 0.303 0.2650.073±0.078 ±0.178 ±0.202±0.121 ±0.049 ±0.064P值 -▲P＜0.001※P＞0.05 ※P＝0.05 ※P＜0.005 ※P＜0.001黃素即為紅花總黃色素 ▲與空白組對照比較※與PAF組對照比較上述結果表明，紅花總黃色素腹腔注射，可明顯抑制PAF致小鼠局部毛細血管通透性增加的作用具明顯的量效關係。其它實施例方法製得的紅花總黃色素依本法實驗所得數據與上述結果趨勢相同。
(4)紅花總黃色素清除自由基作用以鄰二氮菲鐵氧化法檢測紅花總黃色素清除羥自由基的作用，反應體系中含鄰二氮菲0.75mmol/L，FeSO40.75mmol/L，150mmol/L pH7.4磷酸鹽緩衝液，H2O20.01％，加紅花總黃色素(實施例1方法製得)後及其他試劑加H2O2，37℃保溫60分鐘後，測A536nm。以蒸餾水為陰性對照，未損傷管不加H2O2及抗氧化藥。以同濃度紅花總黃色素稀釋液為比色空白。羥自由基清除率計d算法d＝[(A536加藥-A536損傷)/(A536未損傷-A536損傷)]×100％結果紅花總黃色素濃度(g/L) 羥自由基清除率(％)0.0 0.010.153.911.060.311.870.012.668.914.374.7結果表明，紅花總黃色素清除羥自由基的作用具明顯的量效關係。其它實施例方法製得的紅花總黃色素依本法實驗所得數據與上述結果趨勢相同。
實施例以下實施例是為了更詳細地說明本發明的實施方法，而不是為了限制本發明。實施例1 聚醯胺層析法製備紅花總黃色素取100克紅花生藥藥粉，每次加0.5公斤水室溫浸48小時，其間不時攪拌，共提取兩次，合併兩次水提液，過濾除去藥渣，80-100度濃縮至200毫升甲得紅花水提濃縮液。取上述紅花水提濃縮液，上柱床體積為3000毫升的聚醯胺柱(聚醯胺粒度為60-80目)，以蒸餾水洗脫至洗脫液Molish反應及茚三酮反應陰性，以40重量百分比乙醇洗脫聚醯胺柱上吸附的紅花黃色素至洗脫液無色即可上述洗脫液回收乙醇，80-100度濃縮，乾燥即得紅花總黃色素。實施例2 聚醯胺層析法製備紅花總黃色素取100克紅花生藥藥粉，每次加0.5公斤甲醇室溫浸48小時，其間不時攪拌，共提取兩次，合併兩次提取液，過濾除去藥渣，回收溶劑，80-100度濃縮至200毫升即得紅花水提濃縮液。取上述紅花水提濃縮液，上柱床體積為3000毫升的聚醯胺柱(聚醯胺粒度為60-80目)，以蒸餾水洗脫至洗脫液Molish反應及茚三酮反應陰性，以95重量百分比乙醇洗脫聚醯胺柱上吸附的紅花黃色素至洗脫液無色即可。上述洗脫液回收乙醇，80-100度濃縮，乾燥即得紅花總黃色素。實施例3聚醯胺層析法製備紅花總黃色素取100克紅花生藥藥粉，每次加3000毫升50重量百分比乙醇室溫浸48小時，其間不時攪拌，共提取兩次，合併兩次提取液，過濾除去藥渣，回收乙醇，80-100度濃縮至40毫升即得紅花提取濃縮液。取上述紅花提取濃縮液，上柱床體積為1200毫升的聚醯胺柱(聚醯胺粒度為60-80目)，以蒸餾水洗脫至洗脫液Molish反應及茚三酮反應陰性，以75重量百分比乙醇洗脫聚醯胺柱上吸附的紅花黃色素至洗脫液無色即可。上述洗脫液回收乙醇，80-100度濃縮，乾燥即得紅花總黃色素。實施例4矽膠吸附法製備紅花總黃色素取100克紅花生藥藥粉，每次加0.5公斤水室溫浸48小時，其間不時攪拌，共提取兩次，合併兩次水提液，過濾除去藥渣，80-100度濃縮至200毫升即得紅花水提濃縮液取上述紅花提取濃縮液與1000克矽膠H粉(30-60目)拌勻，60度減壓烘乾後以2000毫升40重量百分比乙醇洗脫上述矽膠即得紅花總黃色素洗脫液。取紅花總黃色素洗脫液，回收乙醇，80-100度濃縮蒸乾後即得紅花總黃色素。實施例5矽膠吸附法製備紅花總黃色素取100克紅花生藥藥粉，每次加0.5公斤甲醇室溫浸48小時，其間不時攪拌，共提取兩次，合併兩次提取液，過濾除去藥渣，回收溶劑，80-100度濃縮至200毫升即得紅花水提濃縮液。取上述紅花提取濃縮液與1000克矽膠H粉(30-60目)拌勻，60度減壓烘乾後以2000毫升95重量百分比乙醇洗脫上述矽膠即得紅花總黃色素洗脫液。取紅花總黃色素洗脫液，回收乙醇，80-100度濃縮蒸乾後即得紅花總黃色素。實施例6矽膠吸附法製備紅花總黃色素取100克紅花生藥藥粉，每次加3000毫升50重量百分比乙醇室溫浸48小時，其間不時攪拌，共提取兩次，合併兩次提取液，過濾除去藥渣，回收乙醇，80-100度濃縮至40毫升即得紅花提取濃縮液。取上述紅花提取濃縮液與1200克矽膠H粉(30-60目)拌勻，60度減壓烘乾後以2000毫升75重量百分比乙醇洗脫上述矽膠即得紅花總黃色素洗脫液。取紅花總黃色素洗脫液，回收乙醇，80-100度濃縮蒸乾後即得紅花總黃色素。製劑實施例1紅花總黃色素口服硬膠囊劑紅花總黃色素100克幹澱粉 100克上述組分混合後裝入1000個硬膠囊，即得紅花總黃色素口服硬膠囊劑製劑實施例2紅花總黃色素注射劑紅花總黃色素50克注射用水適量全量1000毫升取50克紅花總黃色素以適量注射用水溶解後加至1000毫升按常規方法經灌裝，封口等步驟製得紅花總黃色素注射劑。製劑實施例3紅花總黃色素栓劑紅花總黃色素500克半合成脂肪酸甘油脂 適量製成1000粒取半合成脂肪酸甘油脂加熱使融，適當降溫後加入500克紅花黃色素混勻，制栓，冷卻即得紅花總黃色素栓劑。製劑實施例4 紅花總黃色素口服液紅花總黃色素0.5克蒸餾水 10毫升紅花總黃色素溶解後按常規方法經灌裝，封口等步驟生產即得紅花總黃色素口服液。製劑實施例5紅花總黃色素片劑紅花總黃色素500克硬脂酸鎂5克澱粉 20克製成 1000片紅花總黃色素，硬脂酸鎂與澱粉混勻後按常規方法經壓片，包衣，裝瓶等工藝即得紅花總黃色素片劑。
此外，在未違背本發明精神內，可以對給定的實施例進行各種變化和改進。由本技術領域中熟練的技術人員認識到的可選擇的實施例，它們也被包括在權利要求的範圍內。
權利要求
1.一種紅花總黃色素，該紅花總黃色素可用下述方法製備獲得(1)以紅花為原料，加入適量的極性溶劑浸提，濾除藥渣合併浸提液，濃縮得到提取濃縮液；(2)把上述步驟得到的提取濃縮液進行柱層析，以水洗脫除去雜質，或以層析擔體吸附雜質；(3)以極性洗脫液洗脫紅花總黃色素，收集洗脫液，回收溶劑，濃縮乾燥即得。
2.一種紅花總黃色素的製備方法，該方法包括下述順序的步驟(1)以紅花為原料，加入適量的極性溶劑浸提，濾除藥渣合併浸提液，濃縮得到提取濃縮液；(2)把上述步驟得到的提取濃縮液進行柱層析，以水洗脫除去雜質，或以層析擔體吸附雜質；(3)以極性洗脫液洗脫紅花總黃色素，收集洗脫液，回收溶劑，濃縮乾燥即得。
3.權利要求2的製備方法，其特徵在於所述的提取是以極性溶劑提取2-4次，每次1-3天，提取用適量極性溶劑用量為紅花生藥重量的5-50倍。
4.權利要求2的製備方法，其特徵在於提取所用的極性溶劑為水或濃度不大於50重量百分比的乙醇，甲醇或丙醇水溶液。
5.權利要求2的製備方法，其特徵在於所述的用於除雜質的紅花提取濃縮液濃度相當於0.5-10克生藥/毫升。
6.權利要求2的製備方法，其特徵在於以聚醯胺柱層析法去除紅花提取濃縮液中的雜質，且其紅花提取濃縮液與所用聚醯胺粉之比按體積計為1∶1-30。
7.權利要求2的製備方法，其特徵在於以矽膠吸附紅花提取濃縮液中的雜質，且其紅花提取濃縮液與所用矽膠粉之比按體積計為1∶1-30。
8.權利要求2的製備方法，其特徵在於所述的用於洗脫紅花總黃色素的極性洗脫液為水或者濃度為20-95重量百分比的乙醇，甲醇或丙醇水溶液。
9.權利要求2的製備方法，其特徵在於所述的用於洗脫紅花總黃色素的極性洗脫液為水或者濃度為40-95重量百分比的乙醇，甲醇或丙醇水溶液。
10.一種治療心腦血管疾病的藥物，其特徵在於含有治療或預防心腦血管疾病有效量的權利要求1的紅花總黃色素和可藥用的載體。
11.權利要求10的藥物，其特徵在於可以製成膠囊，針劑，片劑，栓劑和口服液等。
12.權利要求1的紅花總黃色素在製備預防及治療血小板激活因子與自由基所致損傷疾病的藥物中的應用。
13.一種治療心腦血管疾病的保健品，其特徵在於含有治療或預防心腦血管疾病有效量的權利要求1的紅花總黃色素和可藥用的載體。
14.權利要求13的保健品，其特徵在於可以製成膠囊，針劑，片劑，栓劑和口服液等。
15.權利要求1的紅花總黃色素在製備預防及治療血小板激活因子與自由基所致損傷疾病的保健品中的應用。
全文摘要
本發明涉及從中藥紅花中提取的紅花總黃色素,其製備方法及其製藥領域中的新用途,上述總黃色素製成的藥物及保健品製劑、紅花總黃色素具消除自由基,抑制血小板激活因子的作用,可治療或預防多種心腦血管疾病。
文檔編號C07H15/00GK1264708SQ9812512
公開日2000年8月30日 申請日期1998年11月24日 優先權日1998年11月24日
發明者金鳴, 李家實, 王玉芹, 楊樹東, 陳文梅, 吳偉, 李金榮 申請人:北京市心肺血管疾病研究所