一種純化製備赭麴黴毒素a和赭麴黴毒素b的方法

2023-06-05 03:14:16 2

一種純化製備赭麴黴毒素a和赭麴黴毒素b的方法
【專利摘要】本發明提供了一種純化製備赭麴黴毒素A和赭麴黴毒素B的方法。該方法包括產毒培養基的製備、毒素的提取濃縮、分離及重結晶等步驟。此工藝簡單有效，可應用於大規模工業化生產。同時製備得到的赭麴黴毒素A和赭麴黴毒素B純度達到98％以上，可將其作為標準參考物質應用於糧食及食品中赭麴黴毒素的安全監控及相關科學研究。
【專利說明】一種純化製備赭麴黴毒素A和赭麴黴毒素B的方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種從人工接種的培養基中提取、分離純化真菌產生的次級代謝產物的方法，屬於天然產物提取領域。

【背景技術】
[0002]赭麴黴毒素(ochratoxins)是由麴黴菌屬和青黴菌屬的某些菌株所產生的一類具有致癌、致畸、免疫抑制和肝腎毒性的有毒代謝產物。赭麴黴毒素主要包括赭麴黴毒素A(OTA)及甲酯化合物、赭麴黴毒素B(OTB)、赭麴黴毒素C(OTC)和赭麴黴毒素D(OTD)。其中，OTA和OTB是自然界中汙染水平最為嚴重的兩種赭麴黴毒素，可廣泛存在於糧食、大豆、花生、飼料、咖啡、白酒、葡萄及葡萄酒、動物腎臟及牛奶等不同農產品中。
[0003]研究表明，OTA主要對腎臟產生危害，可造成腎腫大。它也可破壞免疫系統，引起肝臟的急性功能性障礙、脂肪變性和腸炎等。人和動物長期攝入被OTA汙染的食物或飼料可引起致癌、致畸、致突變等作用。因此，在1993年國際癌症中心已經將OTA列為可能的致癌物(2B類)。另外，在歐洲巴爾幹地區，它被懷疑與地方流行性腎病有關。OTB是OTA的非氯同系物。在自然界中它的生物量約為OTA的1/5。OTB具有較小的毒性。但是在體外試驗表明它和OTA具有相同的細胞毒性。
[0004]鑑於赭麴黴毒素在食品中的廣泛汙染及毒性,世界各國對赭麴黴毒素已經建立了不同的限量標準及法律法規。歐盟頒布的《食品中真菌毒素限量標準(EC)N0.466/2001》規定穀物中的最大限量為5 μ g/kg,穀物製品中為3 μ g/kg,葡萄乾中為10 μ g/kg ;我國於2011頒布了新修訂的真菌毒素限量標準即標準《GB 2761-2011食品安全國家標準-食品中真菌毒素限量》中規定了穀物及穀物製品(玉米、大麥、小麥、玉米面、小麥粉、麥片)、豆類及其製品(幹豆及以幹豆磨成的粉)中OTA最大限量標準為5 μ g/kg。目前國際上還沒有制定OTB的限量標準。
[0005]食品安全監控及赭麴黴毒素毒理學的研究仍然需要大量的純品。目前國內使用的赭麴黴毒素標準物質均為美國、奧地利、新加坡等國外進口產品，價格昂貴OTA約為800元Mg, OTB價格約為3200元/mL(10 μ g/mL)。鑑於此，如果單純依靠購買國外標準物來進行國內食品安全監控及科學研究，可造成巨大的花費且易受到國外的條件限制。經檢索我國至今尚未有赭麴黴毒素標準物質製備方面的報導。因此，迫切需要開發赭麴黴毒素純化製備方法來填補國內空白，從而促進相關領域的監控及研究。
[0006]目前赭麴黴毒素的純化製備方法主要包括兩大類:化學合成法及天然提取法。(I)Sibi等通過結合O-芳香基氨基甲酸酯和苯甲醯胺介導的金屬化反應合成出了 OTA及0ΤΒ。此製備方法需要多步的合成及純化，整個過程OTA產率約為14%，0TB產率約為6%。此製備工藝的低產率極大地限制了其應用於工業化生產；(2)從人工接種的培養基中提取純化目標化合物是另一種製備真菌毒素標準物質的方法。目前從不同培養基中提取純化OTA的方法已經有報導。Davis等通過人工接種麴黴菌孢子液至液體培養基中，然後通過反覆的萃取及重結晶最終獲得OTA。Bunge等將侵染麴黴菌的穀物接種至小麥培養基中，然後經過提取、萃取及多步柱色譜淨化，最後重結晶獲得目標毒素。另外，Peterson等從人工接種的小麥培養基中提取0TA，經過反覆萃取，然後通過製備液相及重結晶獲得0TA。大多數的這些方法樣品前處理需要經過複雜萃取及多步柱層析，生產周期長且消耗大量的有機溶劑，同時獲得的產物純度不高。最重要的是這些方法僅能夠純化製備0TA，不能夠同時製備OTA和OTB兩種毒素。
[0007]隨著液相色譜技術的發展，現有的色譜柱具有更加優異的分離效率及柱效，可以在較短時間內從複雜基質中分離純化目標化合物。本發明利用此技術開發出一種可同時純化製備赭麴黴毒素A和赭麴黴毒素B的方法。


【發明內容】

[0008]本發明的目的在於提供一種純化製備赭麴黴毒素A和赭麴黴毒素B的方法。該方法操作簡單、生產成本低，可用於大規模工業化生產。製備得到的OTA和OTB純度高，可作為標準物質應用於食品安全監控及毒理學實驗。
[0009]本發明提供的一種製備赭麴黴毒素A和赭麴黴毒素B的方法，具體包括如下步驟:
[0010](I)孢子液的製備麴黴菌或青黴菌的菌株接種在馬鈴薯培養基(PDA)上黑暗條件下28°C培養3d。將5mL滅菌水加入至PDA，使用滅菌後的接種環輕輕刮取培養基表面孢子。然後再用滅菌水反覆衝洗PDA，合併洗液且在-20°C條件下保存。
[0011](2)產毒培養基的製備稱取適量小麥於錐形瓶中，加入適量去離子水浸泡lh，然後高溫高壓滅菌。待冷卻至室溫後，將步驟(1)所製備的孢子液接種至培養基。在28°C條件下避光培養30d。
[0012](3)毒素的提取培養結束後小麥培養基在50°C乾燥箱中乾燥24h，然後使用高速粉碎機粉碎。稱取適量粉碎後的樣品置於錐形瓶中加入80%甲醇/水超聲提取，提取液於4°C條件下放置12h以沉澱顆粒性物質。雙層紗布過濾後在40°C下旋轉蒸發至原體積的1/5，然後使用酸化的二氯甲烷進行萃取，萃取液40°C條件下濃縮至幹，得到固體殘渣。用30%乙腈/水溶液復溶後，正己烷進行脫脂處理，過0.22 μ m尼龍濾膜待進樣。
[0013](4)製備液相分離純化流動相為甲醇(A)和水(B);流速為3.5mL/min ;色譜柱為Pursuit XRs C18柱(250_X 10mm, 10 μ m);檢測波長為337nm ;進樣體積為3mL ;線性梯度洗脫程序:0min30% A, lmin30% A,20min90% A,21min90% A,22min30% A，此梯度持續3min,總運行時間為25min ;含OTA的餾分收集時間為17.7min至20.6min，含OTB的餾分收集時間為11.1至13.7min。各自餾分液50°C條件下旋蒸後在真空冷凍乾燥機下乾燥，獲得淡黃色固體粉末。
[0014](5)將(4)獲得的固體殘留物用加熱後的苯溶解(溫度不高於40°C)，置於4°C冰箱中有固體結晶狀物體出現，去除母液後，使用4°C苯衝洗兩次獲得白色的固體物質。
[0015](6)將製備得到的OTA及OTB通過超高壓液相色譜進行純度分析，確定:0ΤΑ純度為 98.25 %，OTB 純度為 98.43 %。
[0016](7)通過液相串聯質譜技術，在正離子模式下全掃描分析(m/z200~600)得到OTA為[M+H]+ = 404.04，OTB為[M+H]+ = 370.07，確定其分子量分別為403和369。質譜全掃圖與sigma公司相應的參考標準物質比較幾乎完全一致，間接證明得到的化合物具有高純度；化合物的結構通過產物離子掃描來確證。OTA和OTB產生的產物離子與先前文獻中的報導完全一致，確證了獲得的化合物為OTA和0ΤΒ。
[0017]與現有技術相比，本發明有以下有益的技術效果:
(1)此技術可以同時製備OTA和OTB兩種赭麴黴毒素，通過檢索發現這是首次報導。此方法可以極大的提高生產效率和節約生產成本。
(2)優化產毒培養基此方法通過比較優化不同的培養基及培養時間下OTA和OTB的產量，最終確定小麥為麴黴菌或青黴菌的最佳產毒培養基質，可以獲得高量的赭麴黴毒素。
(3)優化樣品淨化過程為了獲得高純度的OTA和OTB及減少有機溶劑的使用量，不同的萃取溶劑及萃取條件進行比較和優化，最終選擇酸化的二氯甲烷做為最佳萃取溶劑。此萃取溶劑減少了萃取過程中有機溶劑的使用量。
(4)通過製備液相的分離純化最終從10g小麥培養基中得到69mgOTA和6mg OTBjife度均達到98%以上，優於先前文獻中報導的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明
[0019]圖1為赭麴黴毒素A和赭麴黴毒素B純化製備流程圖。
[0020]圖2 (a)為赭麴黴毒素粗提液的製備液相圖譜；(b)為上樣體積為5mL時收集懼分液的超高壓液相色譜圖；(C)為上樣體積為3mL時收集餾分液的超高壓液相色譜圖。
[0021]圖3為超高壓液相色譜圖(a)萃取前粗提液；(b)萃取後粗提液；(c) OTA和OTB標準物質；(d)純化後OTA ； (e)純化後OTB。
[0022]圖4為質譜圖(a)OTA全掃描圖譜；(b)OTB全掃描圖譜；(c)OTA產物離子掃描圖譜；(d)OTB產物離子掃描圖譜。

【具體實施方式】
[0023]下面給出的實施例對本發明作進一步的說明，特別需要指出的是所有類似的替換或更改，均被視為包括在本發明。
[0024]實施例1:
(1)麴黴菌接種至PDA培養基，在28°C條件下培養3d後加入5mL滅菌水，用滅菌後的接種環輕輕刮取培養基表面的孢子。用滅菌水反覆衝洗，合併洗液。通過血球計數板計數調節濃度至1.0X 15個/mL，-20°C條件下保存。
(2)稱取75g小麥於500mL錐形瓶中，加入35mL去離子水，在121°C下高溫滅菌30min。冷卻至室溫後，孢子液接種至滅菌的小麥培養基，在28°C條件下培養30d。培養結束後，小麥培養基在50°C乾燥箱中乾燥24h，然後使用高速粉碎機粉碎成均勻的粉末。
(3)稱取10g乾燥粉末置於錐形瓶中加入400mL不同提取溶劑(80/20乙腈/水，79/20/1乙腈/水/乙酸，80/20甲醇/水，79/20/1甲醇/水/乙酸，乙酸乙酯，甲苯、含I %碳酸氫鈉水溶液)進行超聲提取。提取液於4°C條件下放置12h以沉澱顆粒性物質，定性濾紙過濾。在40°C下旋轉蒸發至提取液減少約4/5後，用含1%乙酸的二氯甲烷萃取，然後40°C下濃縮至幹，得到黃色固體物質。
(4)固體物質用30%乙腈/水溶液復溶後，正己烷進行脫脂處理，過0.22 μ m尼龍濾膜後通過製備液相進行分離純化。流動相為甲醇㈧和水⑶；流速為3.5mL/min ;色譜柱為Pursuit XRs C18柱(250_X 1mm, 10 μ m);檢測波長為337nm ;進樣體積為3mL ;線性梯度洗脫程序:0min30% A, lmin30% A,20min90% A,21min90% A,22min30% A，此梯度持續3min，總運行時間為25min ;含OTA的餾分收集時間為17.7-20.6min，含OTB的餾分收集時間為11.1-13.7min。餾分液在50°C條件下旋蒸後於真空冷凍乾燥機下乾燥，獲得淡黃色固體粉末。
(5)淡黃色的固體粉末用加熱後的苯溶解(溫度不高於40°C )，置於4°C冰箱中有固體結晶狀物體出現，去除母液後，使用4°C苯衝洗兩次獲得白色的固體物質。
[0025]實施例2:
麴黴菌孢子液製備同實施例1。稱取75g燕麥於500mL錐形瓶中，加入35mL去離子水，在121 °C高溫滅菌30min ;其餘步驟同實施例1。
[0026]實施例3:
麴黴菌孢子液製備同實施例1。稱取75g玉米於500mL錐形瓶中，加入35mL去離子水，在121 °C高溫滅菌30min ;其餘步驟同實施例1。
[0027]實施例4:
麴黴菌孢子液製備同實施例1。稱取75g大米於500mL錐形瓶中，加入35mL去離子水，在121 °C高溫滅菌30 min ;其餘步驟同實施例1。
【權利要求】
1.一種純化製備赭麴黴毒素A和赭麴黴毒素B的方法,其特徵在於: 該方法包括如下步驟: (1)將麴黴菌、青黴菌或其孢子液接種至滅菌後的培養基進行產毒培養； (2)培養基經過提取、過濾及濃縮後使用有機溶劑進行萃取； (3)萃取後的溶液通過製備液相進行分離，分別收集餾分液蒸乾復溶後重結晶獲得目標毒素； (4)獲得的毒素通過超高壓液相色譜及液相串聯質譜等進行純度分析、結構確證。
2.如權利要求1所述一種純化製備赭麴黴毒素A和赭麴黴毒素B的方法，其特徵在於所述步驟(1)中的麴黴囷、青黴囷或其抱子液為可廣生赫麴黴毒素A和赫麴黴毒素B的囷株。
3.如權利要求1所述一種純化製備赭麴黴毒素A和赭麴黴毒素B的方法，其特徵在於所述步驟(1)中的培養基為:包括小麥、燕麥、蕎麥、大米、玉米及高梁等糧食類，及有利於步驟(1)中菌株生長產毒的培養基。
4.如權利要求1所述一種純化製備赭麴黴毒素A和赭麴黴毒素B的方法,其特徵性為:步驟(2)中提取所用溶劑為甲醇、乙腈及其不同比例水溶液。萃取溶劑為可以從水溶液中萃取赭麴黴毒素的有機試劑，如二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯及乙酸乙酯等。
5.如權利要求1所述一種純化製備赭麴黴毒素A和赭麴黴毒素B的方法，其特徵性為:步驟(3)中製備液相色譜柱為:反相色譜柱，例如C8、C18柱等。
6.如權利要求1所述一種純化製備赭麴黴毒素A和赭麴黴毒素B的方法,其特徵性為:步驟(3)中重結晶中所用的溶劑為加熱後的苯，同時加熱溫度不能超過40°C。
【文檔編號】C12P17/06GK104178535SQ201410155926
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年4月9日 優先權日:2014年4月9日
【發明者】武愛波, 趙志勇, 宋素泉, 王建華, 劉娜, 聶冬霞, 楊憲立, 林善海 申請人:上海市農業科學院, 上海科立特農產品檢測技術服務有限公司