基於zn(ii)的比色檢測劑和其製備方法

2023-06-26 22:22:16

專利名稱：基於zn(ii)的比色檢測劑和其製備方法
基於ZN(II)的比色檢測劑和其製備方法本發明的領域
本發明涉及式IA的化合物,其用作活細胞的可行的染色劑(staining agent)。
權利要求
1.式IA的化合物
2.權利要求I所要求的化合物，其中它在性質上是非親脂性的。
3.權利要求I所要求的化合物，其中所述化合物是比色檢測劑，並且用作活細胞的可 行的染色劑。
4.權利要求3所要求的化合物，其中所述活細胞選自原核和真核細胞。
5.權利要求3所要求的化合物，其中使用的原核細胞是桿菌物種和假單胞菌物種。
6.權利要求3所要求的化合物，其中使用的真核細胞是酵母(釀酒酵母)。
7.製備式IA的化合物的方法，包括下列步驟 i.在速率為300至600rpm(每分鐘旋轉)的溫和攪拌下，在25_30°C範圍內的溫度下，將1，4，8，11-四氮雜環十四烷溶解在溶劑中； ii.將步驟(i)所獲得的溶液在冰中、在2至5°C範圍內的溫度下保持； iii.在300至600rpm速率的溫和攪拌下，以0. 5至I. 0 mL/分鐘的速率向步驟(ii)所獲得溶液中加入三乙胺鹼； iv.在0至5°C範圍內的溫度下，以15至60mL/小時範圍內的速率向步驟(iii)所獲得溶液中加入單獨製備的4-(4』 -二甲基氨基-苯基偶氮)苯磺醯氯的四氫呋喃溶液； V.在25至30°C的溫度範圍內，將步驟(iv)所得到的混合物攪拌5至10小時； vi.在65至70°C範圍內的溫度下，將步驟(V)所獲得的混合物回流20至60分鐘； vii.將步驟(vi)所獲得的混合物過濾，以分離配體的沉澱； vi ii.將步驟(vii)所獲得配體的沉澱洗漆並乾燥； ix.在20至25°C範圍內的溫度下，將步驟(viii)所獲得的配體溶解在醇中； X.在20至25°C範圍內的溫度下，將硝酸鋅溶液(配體的0. 3至0. 8摩爾當量)加入到步驟(ix)所獲得的配體溶液中； xi.在25至30°C的溫度範圍內，將步驟(X)所獲得的溶液攪拌12至24小時； xii.在10至20°C的溫度範圍內，將步驟(xi)所獲得的溶液攪拌2至5小時； xiii.過濾步驟(xii)所獲得的沉澱，並用氯仿洗滌，獲得式IA的化合物。
8.權利要求7的步驟(i)所要求的方法，其中使用的溶劑選自氯仿、甲醇、二氯甲烷和四氫呋喃(THF)。
9.權利要求7的步驟(ix)所要求的方法，其中使用的醇選自甲醇和乙醇。
10.使用權利要求I所要求的化合物將活細胞染色的方法，其中所述步驟包含 a在30至40°C範圍內的溫度下，在葡萄糖酵母提取物瓊脂(GYE)培養基中培養(i)酵母物種(MTCC 5548)，在營養肉汁中培養(ii)桿菌物種(MTCC 5549)，在King’s B培養基中培養(iii)假單胞菌物種(MTCC 5550)，培養時間在6至36小時範圍內； b在28至38°C的溫度範圍內，用0. 6xl0_4至I. 2x1 O^4 M的式IA化合物將步驟(a)的細胞培養5至20分鐘； c在pH值為7.4至7.6範圍內的緩衝劑中，在28至38°C範圍內的溫度下，將步驟(b)獲得的培養的樣品用戊二醛固定10至12小時； d將步驟(c)所獲得的樣品用所述緩衝劑洗滌0. 5至I. 0小時；e用四氧化鋨和緩衝劑後固定步驟(d)所獲得的樣品，並用所述緩衝劑洗滌；f利用梯度水_乙醇系列，從步驟(e)所獲得的樣品中除去水；g用所述緩衝劑衝洗步驟(f)所獲得的樣品，並在噴射塗布機中用金塗潰，獲得在單式顯微鏡下觀察的染色樣品； h用染色細胞的不同顏色強度和形狀來辨別活細胞。
11.權利要求10所要求的方法，其中使用的緩衝劑是磷酸鹽緩衝劑。
12.權利要求10所要求的方法，其中用掃描電子顯微(SEM)分析來證明檢測劑與活細胞的結合。
13.權利要求10所要求的方法，其中用染料染色之後細胞的活力是如下證明的用懸滴法在凹載玻片中觀察試驗微生物中的二分體，其顯示細胞分裂的出現。
14.權利要求10所要求的方法，其中用枸櫞酸鈉20%(w/v)溶液使細胞褪色、通過光學顯微鏡和紫外-可見光譜來檢測式IA化合物的可逆性結合。
15.權利要求10所要求的方法，其中用式IA化合物進行活細胞的染色，這是由於檢測劑與存在於活細胞的細胞壁上的ATP形成七配位的物種，其中三個磷酸基與Zn配位，並且所有三個磷原子都獲得31P NMR位移。
16.權利要求10所要求的方法，其中加入ATP之後，式IA化合物的吸收光譜滴定曲線顯示了 40 nm的譜移，並且化合物與ATP的結合常數是(978±4)M'
17.權利要求I所要求的式IA的化合物，其中在a-CD (環糊精)的存在下，式IA化合物在水中的溶解度提高大約7至7. 5倍。
18.權利要求I所要求的式IA的化合物，其中在a-CD (環糊精)的存在下，式IA化合物的染色強度提高，顯示出加入a-CD(環糊精)的水溶液時，基於鋅(II)的比色檢測劑L. Zn的最大吸收傾向於移動5 nm。
19.權利要求10所要求的方法，其中利用式IA化合物的染色在10-20分鐘發生，而在a-CD(環糊精)的存在下，在I秒鐘至2分鐘發生，說明在a-CD(環糊精)的存在下，式IA化合物的染色速度提高。
20.權利要求10所要求的方法，其中發現沒有染料的酵母物種細胞表面的SEM成像是光滑的，而在染料存在下的酵母物種細胞表面發現是粗糙的。
21.權利要求10所要求的方法，其中發現沒有染料的Gram+M細菌的SEM成像是光滑的，而帶有染料的是粗糙的。
22.權利要求10所要求的方法，其中發現沒有染料的Gram細菌的SEM成像是光滑的，而帶有染料的是粗糙的。
23.權利要求10所要求的方法,其中與染色的Gram~ve細菌的染色細胞相比較,Gram+ve細菌的染色細胞顯得更長。
全文摘要
本發明描述了具有氮雜-大環Zn(II)-配合物(L.Zn)(反應路線1，式1A)的新的比色化學檢測劑分子，其可以在水介質(pH7.4)中選擇性和有效地辨別ATP(三磷酸腺苷)(生物學重要的三磷酸酯)。由於ATP是活性有機體的能源，所以，通過與代謝過程期間原位形成的ATP結合，L.Zn(反應路線1，式1A)還可以用作活細胞的染色劑。發現L.Zn(反應路線1，式1A)對活細胞是無毒的，並且可以監測微生物細胞的生長研究。由此，L.Zn(反應路線1，式1A)可以用作可行的染色劑。進一步的，在α-CD(環糊精)的存在下(反應路線2)，L.Zn(反應路線1，式1A)在水中的溶解度提高。這有助於實現活細胞的更快和更強烈的染色。由此，通過使用α-CD，還可以進一步提高染色效果。
文檔編號C07D257/02GK102971303SQ201180022839
公開日2013年3月13日 申請日期2011年3月21日 優先權日2010年5月31日
發明者P.馬哈託, A.戈什, S.K.米什拉, A.什裡瓦斯塔瓦, S.米什拉, A.達斯 申請人:科學及工業研究委員會