一個編碼β-環糊精葡萄糖基轉移酶的基因及其應用的製作方法

2023-11-10 22:14:42

專利名稱：一個編碼β-環糊精葡萄糖基轉移酶的基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一個編碼β-環糊精葡萄糖基轉移酶的基因，該基因編碼的蛋白質可用澱粉為原料直接來生產β-環糊精。
背景技術：
環糊精葡萄糖基轉移酶(CyclodextrinGlycosyltransferase,CGTase)為食品工業中的重要酶。CGTase能夠催化4種不同的酶反應，分別為水解、環化、歧化和偶聯反應。環糊精葡萄糖基轉移酶(EC 2. 4. 1. 19)是糖基水解酶α -澱粉酶家族(糖基水解酶家族13) 的重要成員，其獨特功能是將澱粉轉化為環糊精。環糊精(Cyclodextrin，簡稱⑶)是由澱粉或澱粉衍生物在環糊精葡萄糖基轉移酶的環化反應催化下生成的環狀α-1，4-葡聚糖，是非還原性的麥芽低聚糖。⑶通常由6-12個D-吡喃葡萄糖基以α-1，4_葡萄糖苷鍵連接而成，其中研究最多、應用最廣的是由6，7和8個葡萄糖殘基組成的環糊精，分別稱為α-、β-和γ-⑶(Ronan Μ. Kelly, Lubbert Dijkhuizen, Hans Leemhuis. 2009. The evolution of cyclodextrin glucano-transferase product specificity. App1. Microbiol. Biotechnol. ,84 (1) 119-133.)。環糊精中葡萄糖單元的空間排列，使其外緣親水而內腔疏水，因而環糊精能夠作為宿主分子和多種疏水性客體分子結合形成包絡配合物，從而改變客體分子的性質。因此，環糊精在食品、醫藥、化妝品、農業等相關領域具有廣泛的用途(Del Valle EMM. 2004. Cyclodextrins and their uses :a review. Process Biochem. ,39(9) : 1033-1046·)0目前，環糊精主要是用於食品工業中(Lajos Szente, Jozsef Szejtli. 2004. Cyclodextrins as food ingredients. Trends Food Sci. Tech. , 15 (3-4) :137-142.)。其功能主要包括以下幾個方面(1)穩定食品中的某些成分。( 除去食品中的臭味和苦澀味。 (3)可以使某些食品形成長期穩定的乳狀液。(4)增大食品的起泡力。( 將液體食品變為固體粉末，便於包裝、運輸、貯存和使用。如用環糊精製粉末酒，穩定性高，加冷水溶解與原來酒風味相同。(6)與防腐劑一起使用，可提高防腐效果。環糊精本身不能防腐，但與防腐劑一起使用，可使防腐劑長期有效。(7)作為食品生產輔料。另外，目前環糊精比較流行的一種應用是從動物製品如雞蛋和奶製品中去除膽固醇，經過環糊精處理，能夠去除製品中80%的膽固醇，也能從脂肪中去除自由脂肪酸，從而改善脂肪的油炸性能，如減少油煙和氣泡、不易褐變等；水果和蔬菜汁也能通過環糊精處理去除能引起酶褐變的酚類化合物。由於環糊精是無毒或非常低毒的，對健康無任何危害，可以安全地用於食品工業中(C. Munro, P. M. Newberne, V. R. Young, et al. 2004. Safety assessment of γ -cyclodextrin. Regul. Toxicol. Pharmacol. 39 (Suppl. 1) :3-13.)。在醫藥工業中，CD是近年來發展起來的一種新型藥物載體，它能利用其中空圓筒型特殊結構將藥物分子全部或部分包合而形成非鍵類複合物，其劑型類似微膠囊， 但環糊精對藥物呈單分子水平包合，故又稱分子膠囊，該技術可產生微膠囊和毫微膠■的牛寺(Mark Ε. Davis, Marcus Ε. Brewster. 2004. Cyclodextrin-based
pharmaceutics :past, present and future. Nature reviews, 3 (12) : 1023-1035.)。環糊精在心腦血管藥物、抗結核藥物、高血壓藥物、腸胃病藥物等方面有了比較普遍的應用。在醫藥工業中，環糊精主要用於以下方面(1)增加藥物的溶解度。( 增加藥物的穩定性。(3) 降低藥物的刺激性、毒性和副作用，掩蓋苦味。(4)揮發性液體和固體、油狀液體的粉末化。 (5)提高藥物的生物利用度。(6)防止藥物與藥物、藥物與添加劑之間的相互作用。在化妝品領域中，環糊精主要用於增溶香精，防止香精揮發損失；控制對皮膚有刺激性的表面活性劑使用量，增加化妝品透明感，並不產生油分離析現象；將化妝品的活性成分包合起來，使它不易被氧化和分解，起到穩定的作用(Malton，Peter James, Holland, Lynette Anne Makins> Rizzi, George. 2000. Cosmetic compositions comprising cyclic oligosaccharides and fragrance. Wo Pat，2000/067716.)。目前,世界上一些著名的化妝品公司基本上都將環糊精使用於個人護理產品，主要是利用環糊精的包合和緩釋特點，將這些活性物質和香味包合起來，遇到人體皮膚的溫度和溼度以後起到觸發作用，活性物質和香味開始緩慢均衡地從環糊精內孔釋放出來，並且環糊精將體表產生體味的分子吸進內孔中，成了體味吸收劑，從而消除了體味，這是一個動態的過程。除了應用於食品、醫藥和化妝品工業中，環糊精在生物技術、農業、分析化學、環保以及紡織等領域也具有非常廣泛的應用。在生物技術領域，由於環糊精分子空腔對客體分子具有一定的選擇識別能力，因此環糊精可以用於分子識別，並具有模擬酶的功能；在農業方面，環糊精可作為植物生長調節劑，同時能提高農藥的溶解速度和溶解度，增高生物藥效，掩蓋農藥異味；在分析化學中，由於環糊精能影響有色分子的吸收光譜，對顯色反應有增敏、增溶和增穩作用，並且能對手性分子進行識別，能用於各類色譜、光譜和電化學分析中；在環保方面，環糊精對土壤等介質中的三氯乙烯、氯苯、萘、蒽和DDT等弱極性有機汙染物起到增溶作用，並能促進它們的生物降解，CD也能從汙染土壤中萃取有機汙染物然後利用微生物進行降解。α、β和Y三種⑶均為白色結晶粉末，無一定熔點，加熱至200°C左右時開始分解，其中β-CD的水溶解度最低，易於結晶和提純，故其用途引人注目(郭利偉.2007.環糊精葡萄糖基轉移酶高產菌株MSUD5的選育、發酵條件優化與酶學性質的研究.西北大學碩士論文，3-65.)。並且由於環狀糊精的中空圓柱半徑適中，且又具有與澱粉和糊精一樣的安全性，各方面性能最為良好，在CD中具有最廣泛的工業用途。CGTase的生產有兩種途徑，其一是採用天然菌株來發酵生產，主要為細菌(Hans Leemhuis, Ronan Μ. Kelly, Lubbert Dijkhuizen. 2010. Engineering of cyclodextrin glucanotransferases and the impact for biotechnological applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 :823-835.)；其二是構建基因工程菌發酵生產CGTase，與其它表達系統相比，大腸桿菌(Escherichia coli)表達系統具有遺傳背景清楚、操作簡便、可以大規模發酵培養等優點，是現階段最常用的表達系統。一般來講，天然菌株發酵產CGTase 的產量和生產強度均較低，這也是造成環糊精生產成本較高的主要原因之一。目前，國外對CGTase的研究比較深入，而我國對此酶的研究主要集中在生產 CGTase的野生菌株方面，包括篩選野生菌、菌種誘變、發酵條件優化等。並且從自然界中篩選到的產β-CGTase的野生菌株產酶水平普遍較低，且提取純化工藝繁瑣，難以滿足工業化生產的需求。目前，國內只對來源嗜鹼性Bacillus sp. N-227和Paenibacillus sp.這兩個菌株的環糊精葡萄糖基轉移酶基因進行了異源表達的研究，如唐上華等人將來源於嗜鹼性Bacillus sp. Ν-227 β -CGTase基因分別表達於Ε. coli和B. subtlis (枯草芽孢桿菌) 中(唐上華，馮拮，黃蕊新，等.1990.嗜鹼性芽孢桿菌Ν-227 β -環狀糊精葡基轉移酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達.工業微生物，20 :1-5.唐上華，王磊，周新宇.1995.嗜鹼性芽孢桿菌N-227環糊精葡基轉移酶基因在枯草桿菌中的整合表達.工業微生物，25 1-4.)；王媛等人也將該基因在E. coli中進行表達(王蔭榆，王媛，張紅髮，等.2007.來源嗜鹼性芽孢桿菌Ν-227 β -環糊精葡基轉移酶基因分析及在大腸桿菌中的誘導表達.工業微生物.7 (3) :10-14.)。謝振榮等人將來源類芽孢桿菌屬的環糊精葡萄糖基轉移酶基因在大腸桿菌中進行了克隆表達(謝振榮，趙三軍，唐湘華，等.2010.來源I^enibacillus sp.的環糊精葡萄糖基轉移酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達.食品科技，35 (11) 16-19.)。中國專利200910029153. 8公開了「具有高產β -環糊精能力的環糊精葡萄糖基轉移酶的突變體及突變方法」，江南大學的陳堅課題組通過對來源於軟化類芽孢桿菌 (Peanibacillus macerans)FB05-01的α -環糊精葡萄糖基轉移酶進行了一系列的突變， 獲得了高產β-環糊精的α-環糊精葡萄糖基轉移酶突變酶Κ47Τ，該突變酶的環糊精產物中β -環糊精佔總環糊精量的66. 4%。

發明內容
本發明從廣西南寧篩選的克氏類芽孢桿菌GXKPaenikicillus cookii GX-4)中基因克隆到一個β-環糊精葡萄糖基轉移酶，在宿主細胞中表達該基因生產β-環糊精葡萄糖基轉移酶，並以澱粉為原料生產環糊精。本發明涉及一種β-環糊精葡萄糖基酶的基因Pcgt，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，是從實驗室篩選到的克氏類芽孢桿菌GX-4中分離得到。環糊精葡萄糖基轉移酶基因序列的保守區、具有序列表中SEQ ID NO. 1所述的鹼基序列的外源DNA是由2135個鹼基組成，含有完整的β-環糊精葡萄糖基轉移酶基因Pcgt的開放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF), Pcgt基因的起始密碼為ATG，終止密碼子為TAA。Pcgt和芽孢桿菌屬Bacillus sp. B1018 白勺 gene for raw-starch-digesting amylase precursor 同源個生最高，兩者白勺才目似性=2013/2043(99% )。SEQ ID N0.2的蛋白質是基因Pcgt編碼的β -環糊精葡萄糖基轉移酶產物 Pcgt,由692個胺基酸組成，和Pcgt催化功能域同源性最高的為環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)白勺 Precursor，eyelomaltodextrin glucanotransferase, M ^ ffi M ft = 672/693(97% )、相同性=679/693(98% )。基因Pcgt在大腸桿菌中表達的重組產物Pcgt能夠以澱粉為原料生產環糊精。本發明還涉及含有本發明基因的表達載體，及用於轉化本發明基因的宿主。本發明提供了一個環糊精葡萄糖基轉移酶基因，該基因所編碼的環糊精葡萄糖基轉移酶在以澱粉為原料生產β-環糊精中具有廣泛的用途。


圖1是篩選含有β -環糊精葡萄糖基轉移酶基因Pcgt重組菌株的剛果紅+澱粉的選擇平板圖。圖2是β -環糊精葡萄糖基轉移酶Pcgt以澱粉為底物生產環糊精的HPLC圖。從圖1 了解到，含有β -環糊精葡萄糖基轉移酶基因Pcgt的重組菌株能夠在剛果紅+澱粉的選擇平板上形成透明圈。圖2中的A、B和C分別是葡萄糖、α -環糊精和β -環糊精的標樣，D是Pcgt轉化澱粉的產物。從圖2的D中了解到，β -環糊精葡萄糖基轉移酶Pcgt能將澱粉轉化成α _環糊精、β-環糊精和Y-環糊精，其中環糊精產物中β-環糊精的產量佔總環糊精的63. 42%， 見表1所示，表1為Pcgt轉化澱粉的產物比例分析表。
具體實施例方式下述實施方法是為了更好的解釋本發明，而不應該被解釋為限制本發明的目的。在本發明的實施例中所用到的材料包括大腸桿菌(Escherichia coli)株系 XLl-Blue、載體pMD19-T (購自大連TaKaRa公司)；表達載體pSE380購自Stratagene公司， 購自TaKaRa、MBI的限制性內切酶、修飾酶等試劑。下面將通過實施例對本發明作詳細描述1、來自類芽孢桿菌屬的環糊精葡萄糖基轉移酶基因序列分析查找到Genbank資料庫中已公布的兩個來自類芽孢桿菌屬編碼環糊精葡萄糖基轉移酶的基因序列。使用SMART軟體在線分析這兩個基因編碼的蛋白質的結構組件，使用 Vector NTI10.0軟體對環糊精葡萄糖基轉移酶基因序列進行Alignment比對分析，從而獲取環糊精葡萄糖基轉移酶基因序列基因的同源序列。2、β -環糊精葡萄糖基轉移酶基因保守區DNA片段的獲得根據同源序列，設計一對弓I物。P-cgtl 5 『-CAACAAGCAGAANTTCAGCAC-3，P-cgt4 5 『-TTAAGGCTGCCAGTTCAC-3，以從廣西南寧篩選到的克氏類芽孢桿菌GX-4總DNA為模板，聚合酶鏈式反應 (PCR)擴增得到保守區DNA片段，大小約為21Λ。將PCR產物直接與pMD19_T載體連接，於 16°C連接12hr。連接產物全部用於CaCl2法轉化大腸桿菌XL1-Blue感受態細胞中，塗布到含有X-gal、IPTG和100 μ g/mL的氨苄青黴素的LA平板上，37°C培養過夜，待長出單菌落後，分別挑取3個的白色菌落接種於含100 μ g/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中，37°C振蕩培養14hr，小量製備質粒DNA，再分別用限制性內切酶EcoRI完全酶切，進行0. 7 %瓊脂糖凝膠電泳分析，結果這三個白色菌落的質粒DNA均酶切成大小約為4. Skb的DNA條帶。於是，將其中一個質粒DNA進行序列測通，命名為P3-6。然後送交上海生工生物工程公司測定 DNA核苷酸序列。3、β -環糊精葡萄糖基轉移酶基因Pcgt保守區DNA序列的分析Ρ3-6的外源片段大小為2135bp0使用Vector NTI10. 0軟體對P3-6的DNA序列進行開放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF)分析，發現從51_2U9bp處存在一個0RF，由 2079個核苷酸組成，序列如SEQ ID N0. 1。其中，Pcgt基因的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。4、β -環糊精葡萄糖基轉移酶基因Pcgt編碼的產物Pcgt的胺基酸序列分析β -環糊精葡萄糖基轉移酶基因Pcgt編碼一個含692個胺基酸的蛋白質，用 DNAStar軟體預測該蛋白質的理論分子量大小為75觀2. 16道爾頓。使用SMART在線分析Pcgt的胺基酸序列，發現這個蛋白質Pcgt不存在信號肽序列。5、β -環糊精葡萄糖基轉移酶基因Pcgt的克隆和表達使用上遊引物5，-TCGCCATGGTGCACCACCACCACCACCACATTACGCCAGCTTGCATGCTGCA G-3，和下遊引物5，-CACAAGCTTTTAAGGCTGCCAGTTCACGTTAATG-3，，通過 PCR 擴增 β -環糊精葡萄糖基轉移酶基因Pcgt，用限制性內切酶NcoI和HindIII酶切β -環糊精葡萄糖基轉移酶基因Pcgt後，與經NcoI和HindIII酶切的表達載體pSE380進行連接。再將連接產物轉化到大腸桿菌XLl-Blue中，塗布到含ΙΟΟμ g/mL氨苄青黴素的LA平板上。挑取轉化得到的單菌落到0. 01 %剛果紅+1 %澱粉+0. 5mmol/L IPTG+100 μ g/mL氨苄青黴素的LA平板上，將平板置於37°C恆溫箱培養他！·，然後進行氯仿燻蒸破胞，把平板置於37°C恆溫箱使表達的Pcgt酶與底物反應2 !3hr。觀察選擇平板。然後進一步提取能形成透明圈的克隆子的質粒DNA，並將其命名為pSE-Pcgt，用限制性內切酶NcoI和HindIII酶切pSE-Pcgt後，進行0. 7 %瓊脂糖凝膠電泳分析，結果 pSE-Pcgt除有一個4. Ikb的DNA片段外，還有一條大小約為21Λ的DNA片段。將含有質粒pSE-Pcgt的重組大腸桿菌XLl-Blue菌株接種到20mL含100 μ g/mL氨苄青黴素的LB培養基中，37°C振蕩培養，待OD6tltl為0. 4時，加入終濃度為0. 5mmol/L IPTG、 終濃度為100mmol/L山梨醇和終濃度為2. 5mmol/L甜菜鹼，20°C誘導20hr。IlOOOrpm離心3min，收集菌體，用4mL 1 OOmmo 1/L的pH 7. 0磷酸緩衝液重懸菌體，超聲波破胞9min。 12000rpm離心lOmin，上清即為含有β -環糊精葡萄糖基轉移酶Pcgt的粗酶液。6、β -環糊精葡萄糖基轉移酶Pcgt水解澱粉的活力的測定取20 μ 1 β -環糊精葡萄糖基轉移酶Pcgt的粗酶液，加入500 μ 1 IOOmmo 1/L的pH 7. 0磷酸緩衝液，與480 μ 1 1 %澱粉溶液混合，在37°C作用1小時後，加入800 μ 1 DNS溶液，放置沸水中反應5分鐘，室溫冷卻，用分光光度計測吸光度0D53(i。吸光度測定值與不同含量的葡萄糖吸光度標準曲線圖作比較計算酶活。所述DNS試劑配製稱取1克NaOH用約 40mL ddH20溶解，再稱取1克二硝基水楊酸、0. 2克苯酚、0. 05克無水亞硫酸鈉、20克四水酒石酸鉀鈉，將其溶解於約30mL (MH2O中，兩種溶液混合，定容到100mL。β -環糊精葡萄糖基轉移酶Pcgt的水解澱粉活性為212U。7、β -環糊精葡萄糖基轉移酶Pcgt生產環糊精產物的測定β-環糊精葡萄糖基轉移酶以澱粉為底物生產環糊精的反應取20μ 環糊精葡萄糖基轉移酶Pcgt的粗酶液，與(w/v)澱粉溶液(用50mmol/L pH 7. 0磷酸緩衝液溶解)在500 μ 1的反應體系中37°C作用3個小時。反應時間到後，在100°C加熱10分鐘終止反應。Pcgt的產物用高效液相色譜法(HPLC)進行檢測。HPLC檢測的結果顯示Pcgt 的產物中有葡萄糖、α-環糊精、β-環糊精和Y-環糊精存在，其中環糊精產物中β-環糊精產量佔總環糊精的63. 42%。HPLC條件儀器AgilentllOO色譜儀；色譜柱氨基柱；流動相乙腈水(70 30)；流速1. OmL/min ；檢測器RID (折光檢測器)。表1 Pcgt轉化澱粉的產物比例分析表
權利要求
1.一個編碼β-環糊精葡萄糖基轉移酶的基因Pcgt，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
2.根據權利要求1的基因所編碼的蛋白質，其胺基酸序列如SEQID NO. 2所示。
3.—種表達載體，其特徵在於，它含有權利要求1所述的基因。
4.一種宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求3所述表達載體轉化的原核細胞或真核細胞。
5.權利要求2所述的蛋白質在以澱粉為原料生產β-環糊精中的應用。
全文摘要
一個編碼β-環糊精葡萄糖基轉移酶的基因Pcgt，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。該基因編碼的β-環糊精葡萄糖基轉移酶SEQ ID NO.2及該酶在以澱粉為原料生產β-環糊精中的應用。
文檔編號C12N9/10GK102250931SQ20111017118
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月23日 優先權日2011年6月23日
發明者吳磊, 龐浩, 李濤, 杜麗琴, 裴建新, 霍雲龍, 韋宇拓, 黃日波 申請人:廣西大學