一種samhd1基因敲除細胞系的構建方法

2023-07-02 07:47:11

一種samhd1基因敲除細胞系的構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種SAMHD1基因敲除細胞系的構建方法，首先針對SAMHD1基因CDS1和CDS2共設計4對識別序列；然後將靶點識別單元模塊的基因片段分別按照4對識別序列進行串聯，並克隆入pCAG-T7-TALEN(Sangamo)-Destination質粒，構建4對TALEN表達質粒對；將4對TALEN質粒對分別轉染293T細胞，並用新黴素篩選出敲除SAMHD1基因的細胞系；所述方法能夠在基因組SAMHD1靶位點造成移碼突變，形成目標基因敲除突變體，達到從基因組中穩定敲除SAMHD1基因的目的。
【專利說明】-種SAMHD1基因敲除細胞系的構建方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於分子生物學【技術領域】，涉及一種從基因組中敲除SAMHD1基因的方法， 可用於SAMHD1功能研究及構建SAMHD1表達穩定缺失的細胞系。

【背景技術】
[0002] 最近，Laguette N等在HIV-1難以感染的髓系細胞中發現了一種HIV-1的宿主 限制因子--SAMHD1，該分子可以水解dNTPs，從而抑制人類髓系細胞中HIV-1的複製。 SAMHD1全長67020bp，包含16個外顯子，蛋白由626個胺基酸組成。Goldstone等測定了 它的結構和催化活性，晶體結構揭示SAMHD1是一個二聚體，其分子結構包括N-末端的SAM 結構域，HD結構域和C末端區域。HD結構域以組氨酸/天冬氨酸殘基雙聯體基序為特徵， 在進化上高度保守，在核酸代謝和信號傳導等方面發揮重要作用。當SAM結構域缺失時，HD 結構域可以表現完全磷酸水解酶的功能。
[0003] SAMHD1是一種dGTP依賴的磷酸水解酶。SAMHD1先形成二聚體結構的分子，再結 合dGTP，並發生變構，從而暴露出磷酸水解酶的活性。它的主要功能是將dNTPs水解成脫氧 核苷和無機的三磷酸，從而降低核內dNTPs的濃度，參與細胞內的dNTPs代謝過程。SAMHD1 功能的缺失可以造成細胞內dNTPs的大量積聚，從而導致強烈的免疫活化和大量的I型幹 擾素分泌。先天性的SAMHD1基因突變可以引起一種罕見的遺傳性自身免疫性疾病--AGS (Aicardi-GoutiSres syndrome),這是一種類似於先天性宮內病毒感染表現的先天性腦 病，可以引起嚴重的腦萎縮和慢性腦脊液淋巴細胞增多，患者常伴有不適宜的免疫活化和 IFN-a的大量產生。SAMHD1基因缺陷的AGS患者的單核細胞更容易感染HIV-1，進一步在 人體原代細胞上驗證了 SAMHD1的HIV-1感染限制功能。
[0004] 鑑於SAMHD1在細胞核酸代謝和HIV-1感染中的重要作用，敲除SAMHD1蛋白在 SAMHD1的功能研究中是十分重要的手段。目前敲除或降低SAMHD1表達的方法僅限於RNAi， 該方法僅能瞬時降低SAMHD1蛋白的表達，不能形成穩定敲除，更難以建立SAMHD1表達缺 失的細胞系，而且降低的程度也有限，不能完全敲除SAMHD1的表達。因此，有必要開發一種 從基因組中完全敲除 SAMHD1 基因的方法。TALENs(transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的中文名為轉錄激活因子樣效應物核酸酶，是基因組編輯核酸酶三 大類之一。它是實現基因敲除、敲入或轉錄激活等靶向基因組編輯的裡程碑。相比於傳統 的鋅指核酸酶（ZFNs)技術，TALENs具有獨特的優勢：設計更簡單，特異性更高，現在成為了 科研人員用於研究基因功能和潛在基因治療應用的重要工具。是目前較有發展前景的基因 修飾技術。我們以TALENs技術為基礎，開發了一種從基因組中完全敲除SAMHD1基因的方 法。該方法將為研究SAMHD1功能、建立SAMHD1缺失的細胞系以及HIV-1感染機制研究打 下基礎。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是針對目前瞬時敲除SAMHD1方法的不穩定性和不徹底性，提供一 種從基因組中穩定敲除SAMHD1基因的方法，該方法除用於SAMHD1功能研究外，還可以用於 建立SAMHD1表達缺失細胞系，為其它研究提供細胞模型。
[0006] 本發明的目的通過以下技術方案實現：一種SAMHD1基因敲除細胞系的構建方法， 包括以下步驟： (1) 針對SAMHD1基因的⑶S1選取作用靶點，並設計2對識別序列，分別為L1/R1、L2/ R2 ;針對SAMHD1基因的⑶S2選取作用靶點，並設計2對識別序列，分別為L3/R3、L4/R4 ; L1 ?L4 的序列如 SEQ ID N0. 17?SEQ ID N0. 20 所示，R1 ?R4 的序列如 SEQ ID N0. 21 ?SEQ ID NO. 24 所示；Ll/Rl、L2/R2、L3/R3、L4/R4 具體為：

【權利要求】
1. 一種SAMHD1基因敲除細胞系的構建方法，其特徵在於，包括以下步驟： (1) 針對SAMHD1基因的⑶S1選取作用靶點，並設計2對識別序列，分別為Ll/Rl、L2/ R2 ;針對SAMHD1基因的⑶S2選取作用靶點，並設計2對識別序列，分別為L3/R3、L4/R4 ; L1 ?L4 的序列如 SEQ ID NO. 17?SEQ ID NO. 20 所示，R1 ?R4 的序列如 SEQ ID NO. 21 ?SEQ ID NO. 24所示； (2) 將靶點識別單元模塊的基因片段分別按照L1/R1、L2/R2、L3/R3、L4/R4序列進行串 聯，串聯成功後克隆入PCAG-T7-TALEN (Sangamo) - Destination質粒，共構建4對TALEN表 達質粒對；其中，靶點識別單元模塊的基因片段按照L1序列進行串聯後對應的胺基酸序列 如SEQ ID NO. 9所示；按照R1序列進行串聯後對應的胺基酸序列如SEQ ID NO. 10所示；按 照L2序列進行串聯後對應的胺基酸序列如SEQ ID NO. 11所示；按照R2序列進行串聯後對 應的胺基酸序列如SEQ ID NO. 12所示；按照L3序列進行串聯後對應的胺基酸序列如SEQ ID NO. 13所示；按照R3序列進行串聯後對應的胺基酸序列如SEQ ID NO. 14所示；按照L4 序列進行串聯後對應的胺基酸序列如SEQ ID NO. 15所示；按照R4序列進行串聯後對應的 胺基酸序列如SEQ ID NO. 16所示； (3) 將構建好的4對TALEN表達質粒對分別用脂質體轉染試劑盒轉染到表達SAMHD1 的293T細胞系中，48小時後將細胞在含有濃度為100ug/ml的新黴素的DMEM培養基中培養 10-14天，篩選出活細胞，得到敲除SAMHD1基因的細胞系。
【文檔編號】C12N15/85GK104450784SQ201410654987
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月18日 優先權日:2014年11月18日
【發明者】靳昌忠, 吳南屏 申請人:浙江大學