一種保育感染黃龍病柑橘種質的方法
2023-06-14 14:05:51
一種保育感染黃龍病柑橘種質的方法
【專利摘要】本發明涉及一種保育感染黃龍病的柑橘種質的方法，包括砧木的培育與熱處理、接穗的採集和藥物處理、嫁接、管理和檢測。本發明對砧木幼苗進行熱處理，培育無黃龍病砧木、對感染黃龍病但還有生活力的柑橘枝條進行藥物處理，取接穗於藥物處理後的柑橘枝條，嫁接於無黃龍病的砧木上。經嫁接苗成活後4個月、8個月和12個月採集樣品，並進行PCR檢測和發病情況調查，結果表明，本發明能徹底清除柑橘優良種質或品種感病接穗的黃龍病病原菌，直觀、準確評價感病種質資源的恢復和保育效果，快速保護和培育柑橘種質資源。
【專利說明】一種保育感染黃龍病柑橘種質的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種保育感染病害的果樹種質的方法，特別是一種保育感染黃龍病的柑橘種質的方法，屬農業科學領域。
【背景技術】
[0002]柑桔黃龍病是一種由韌皮部桿菌(Ca.Liberibacter)引起的毀滅性、傳染性和檢疫性的重大病害，俗稱柑桔的「癌症」，分布極其廣泛。亞洲、非洲、南美洲等40多個國家和地區均有發生和流行，主要通過柑桔木蝨轉移吸食、帶病苗木和接穗等材料傳播。通常新樹感病後1~2年內即死亡，老樹感病後3~5年內死亡或喪失結果能力，嚴重時可造成毀園。如柑橘黃龍病2005年在美國佛羅裡達首次發現，在短短的5年時間裡，已經擴散到全部34個柑橘產生產縣，造成高達46億美元的經濟損失；同樣，在我國廣西，根據廣西全區各地黃龍病普查的情況看，定植3~4年後，大部分果園的發病率都超過5%，所以廣西每年因該病危害造成的直接經濟損失至少達8.05~9.62億元。柑橘黃龍病的猖獗危害和蔓延擴散，對柑橘產業的穩定和發展造成了嚴重威脅，已經成為柑橘產業發展的重大障礙。
[0003]由於柑橘及其近緣屬植物都沒有發現抗病資源和抗病基因，目前生產上主要採用控制木蝨傳播、砍除帶病植株、減少病原菌量、種植無毒種苗等措施以減少或推遲黃龍病的爆發。由於黃龍病病原菌在柑橘體內的潛伏期長、缺乏有效藥物防治，一旦發病，最終的結果就是死亡，造成很多地方優良品種或優異的育種材料和種質資源瀕臨滅絕。
[0004]經檢索，目前，未見有快速保育因黃龍病的嚴重危害而瀕臨滅絕的柑橘優異種質資源或品種方法的相關文獻報導。本領域技術人員長期渴望找到一種能快速、有效地恢復並保育因受黃龍病影響而瀕臨死亡柑橘種質資源或品種的方法，用於防治柑橘黃龍病和選育柑橘新品種等。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供一種保育感染黃龍病的柑橘種質的方法，能快速、有效地恢復並保育因感染黃龍病而瀕臨滅絕的柑橘種質資源或品種。
[0006]為實現上述目的，本發明採用以下方法和步驟。
[0007]本發明的保育感染黃龍病的柑橘種質資源的方法，其特徵在於步驟如下:
[0008](I)砧木的培育與熱處理:選擇健康砧木母本樹，採摘成熟的果實，經播種、幼苗管護，培育砧木幼苗；砧木幼苗在人工氣候室中進行熱處理，每天35~45°C處理5~15小時，持續5~10天，保育在防蟲溫室中；2~8個星期後，經PCR檢測，選擇沒有檢測到黃龍病病原菌的砧木幼苗，備用；
[0009](2)接穗的採集和藥物處理:採集感染黃龍病但還有生活力的柑橘枝條，每枝帶有I~5張葉片，置於藥物中處理5~15小時，保持通風、光照，溫度控制在20~32°C、相對溼度控制在50~90% ；
[0010](3)嫁接、管理和檢測:取步驟(2)的接穗，嫁接在步驟(1)的砧木幼苗上，分別在嫁接苗成活後4個月、8個月和12個月採集樣品，進行PCR檢測和發病情況調查。
[0011]其中步驟(1)所述砧木幼苗熱處理為每天45°C處理10個小時，持續5天。
[0012]其中步驟(2)所述的藥物為抗生素或抗菌劑或生物殺菌劑或抗菌多肽及其組合，使用濃度為10~1000mg/L。
[0013]本發明的有益效果是:
[0014]1、能徹底清除柑橘優良種質或品種感病接穗的黃龍病病原菌。
[0015]2、能直觀、準確評價感病種質資源的恢復和保育效果。
[0016]3、能快速保護和培育柑橘種質資源。
【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。
[0018](I)柑橘砧木的熱處理:將感病和健康的柑橘砧木幼苗，置於人工氣候室中進行熱處理，每天45°C處理10個小時，然後保持35°C恢復14小時，持續5天，然後將處理的砧木幼苗保育在防蟲溫室中，3個星期後，處理的砧木幼苗恢復生長，分別在熱處理之後的4個月和8個月後，利用定量PCR技術檢測砧木幼苗黃龍病的病原菌數量和熱處理的效果。其中①病原菌DNA的提取:用Qiagen的植物DNA提取試劑盒提取(DNeasy PlantMini Kit, Cat.69106, Qiagen, MO, USA)0將砧木幼苗葉片，撕取中脈，將約200mg中脈裝入2.0ml離心管，加入API緩衝液和RNAase後，用勻漿機(Fast Pr印24 )打碎，然後在65°C下溫育20min，期間反覆顛倒試管2~3次；加入AP2緩衝液置於冰浴中20min，然後在10，OOOXg下離心5min，加入1.5倍體積的AP3/E緩衝液，反覆振蕩數次,轉入微濾柱，10，OOOXg離心Imin ;用AW緩衝液清洗兩次之後再空柱離心徹底甩幹，最後向柱中加入50 μ I AE緩衝液洗脫，8，000 X g離心Imin洗脫植物總DNA，所得用於PCR檢測病原菌的實時定量PCR檢測:利用亞洲韌皮桿菌核糖體蛋白基因16s核糖體DNA的特異性靶序列按照Primer Express軟體(ABI,USA)設計的探針和引物的組合(參考Li等2006的方法):HLBas (5 『-GTCGAGCGCGTATGCAA TACG-3』)、HLBr (5 『-CTACCTTTTTCTACGGGATAACGC-3』)、HLBp (5 『-AGACGGGTGAGTAACGCG-3』)，由上海生物工程公司合成引物，TaqMan螢光探針Y端、3 ^端分別用FAM報導螢光染料和TRAMA淬滅螢光染料標記，鋁膜袋閉光保存於_20°C備用。採用 20 μ I 反應體系，含有終濃度 I XTaqMan qPCR Mix (Applied Biosystems)、300nM(each)引物(HLBas and HLBr)，150nM探針(HLBp)以及適量模板。PCR反應程序:在 ABI PRISM7500 (Applied BiosystemsjFoster City, CA)螢光定量 PCR 儀上進行，預擴增95°C, Imin ;然後95°C，3s，60°C，30s，40個循環；末次延伸72°C，7min ;在每個循環的延伸階段(60°C)同步多次採集螢光，結果如表1所示。
[0019]從表1結果可以明顯看出，上述的熱處理可以明顯清除砧木幼苗的黃龍病病原菌，使嫁接的砧木100%無菌。
[0020] 表1:砧木熱處理的效果
[0021]
【權利要求】
1.一種保育感染黃龍病的柑橘種質資源的方法，其特徵在於步驟如下: (1)砧木的培育與熱處理:選擇健康砧木母本樹，採摘成熟的果實，經播種、幼苗管護，培育砧木幼苗；砧木幼苗在人工氣候室中進行熱處理，每天35~45°C處理5~15小時，持續5~10天，，保育在防蟲溫室中；2~8個星期後，經PCR檢測，取沒有檢測到黃龍病病原菌的砧木幼苗，備用； (2)接穗的採集和藥物處理:採集感染黃龍病但還有生活力的柑橘枝條，每枝帶有I~5張葉片，置於藥物中處理5~15小時，保持通風、光照，溫度控制在20~32°C、相對溼度控制在50~90% ； (3)嫁接、管理和檢測:取步驟(2)的接穗，嫁接在步驟(1)的砧木幼苗上，分別在嫁接苗成活後4個月、8個月和12個月採集樣品，進行PCR檢測和發病情況調查。
2.根據權利要求1所述的一種保育感染黃龍病的柑橘種質資源的方法，其特徵在於所述藥物為抗生素或抗菌劑或生物殺菌劑或抗菌多肽及其組合。
3.根據權利要求1或2所述的一種保育感染黃龍病的柑橘種質資源的方法，其特徵在於所述藥物的使用濃度為10~1000mg/L。
4.根據權利要求1所述的一種保育感染黃龍病的柑橘種質資源的方法，其特徵在於所述砧木幼苗熱處理為每天45°C處理10個小時，持續5天。
【文檔編號】A01G1/06GK103891531SQ201310691323
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年12月12日 優先權日:2013年12月12日
【發明者】張木清 申請人:廣西大學