用於促進骨髓幹細胞歸巢的含引經藥牛膝的中藥組合物的製作方法

2023-06-09 08:03:36 2

專利名稱：用於促進骨髓幹細胞歸巢的含引經藥牛膝的中藥組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥組合物及其應用，具體地說，涉及一種用於促進骨髓幹細胞歸巢的含引經藥牛膝的中藥組合物。
背景技術：
股骨頭壞死是一種發病率、致殘率均較高的骨傷科常見難治性疾病，目前，我國的發病人數約為500 750萬，且每年的新增患者達10 20萬。股骨頭壞死的治療治療有非手術和手術治療兩類，但是總體療效並不滿意，因此，尋求有效的治療方法仍然是研究者們探索的方向。幹細胞治療股骨頭壞死是近年來興起的治療方法，但目前多集中在MSCs移植替代的研究，並且大多數研究還處於體外和動物體內實驗階段，要在臨床推廣應用還需要大量的研究和人體實驗。幹細胞治療的另一種方法是動員自體MSCs到外周血，通過血液循環使其「歸巢」 到病灶，以其無創傷性、不需外科手術或介入治療的專門設備、不必首先在體外分離純化並擴增幹細胞等特點，因而更具有潛在的臨床應用價值。但是由於因損傷引起機體自身修復反應，釋放到外周血的BMSCs數量較少，歸巢到病灶部位的幹細胞數目更是極少，其自我修復的作用也極為有限。因此，如何增加外周血的幹細胞數目及促進幹細胞「歸巢」到病灶， 是自體幹細胞治療的難點。研究已證實，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是強有力的幹細胞動員劑、可以在較短時間內使外周血幹細胞增高數十倍至數百倍。因此，亟需研發具有促進幹細胞歸巢作用的藥物。

發明內容
本發明的目的是提供一種用於促進骨髓幹細胞歸巢的含引經藥牛膝的中藥組合物。為了實現本發明目的，本發明的一種用於促進骨髓幹細胞歸巢的含引經藥牛膝的中藥組合物，由如下重量份的原料藥製成牛膝10 20、黃芪15 45、當歸10 20、川芎 10 20、赤芍6 18、桃仁10 20、紅花10 20、地龍10 20、桂枝10 20、木瓜10 20和威靈仙10 20。優選地，前述含引經藥牛膝的中藥組合物，由如下重量份的原料藥製成牛膝 12 18、黃芪20 40、當歸12 18、川芎12 18、赤芍9 15、桃仁12 18、紅花12 18、地龍12 18、桂枝12 18、木瓜12 18和威靈仙12 18。更優選地，前述含引經藥牛膝的中藥組合物，由如下重量份的原料藥製成牛膝 15、黃芪30、當歸15、川芎15、赤芍12、桃仁15、紅花15、地龍15、桂枝15、木瓜15和威靈仙 15。用於製備本發明中藥組合物的原料藥，其中，黃芪甘溫，益氣助推血行、當歸甘溫， 養生活血，兩者共用為君藥；赤芍酸寒，活血化瘀，桂枝辛溫，溫經通脈，散寒止痛，地龍通經活絡，川芎血中之氣藥，辛溫走竄而行氣，三者活血化瘀止痛為臣藥；木瓜、威靈仙長於疏通經絡，與地龍相配增強疏經通痺之功，桃仁、紅花優於散瘀止痛、通絡，共為佐藥；牛膝，入血分，活血通經，且能引血下行，「能引諸藥下行」，直達病所，為使藥。諸藥合用，共奏益氣活血、疏經通痺之功。本發明所述的重量份可以是yg、mg、g或kg等醫藥領域公知的重量單位。本發明所述含引經藥牛膝的中藥組合物，優選使用口服製劑，包括水煎劑、丸劑、 膠囊劑、顆粒劑、衝劑或口服液等，上述劑型均可以通過本領域常規方法製備得到。其中，優選為水煎劑(湯劑)，其製備方法為將原料藥加5 7倍重量的水，浸泡1 1. 5小時，然後煎煮30分鐘，過濾；藥渣再加3 5倍重量的水，煎煮20分鐘，過濾；合併兩次濾液，製成水煎劑。本發明還提供上述中藥組合物在製備促進骨髓幹細胞歸巢藥物中的應用。本發明進一步提供上述中藥組合物在製備治療股骨頭壞死的藥物中的應用。本發明含引經藥牛膝的中藥組合物，是基於中醫藥引經理論、幹細胞歸巢的理論以及幹細胞技術，結合多年臨床研究，採用益氣活血、疏經通痺之品和引經藥牛膝組成。本發明提供的含引經藥牛膝的中藥組合物具有促進骨髓幹細胞歸巢到股骨頭組織中的作用， 從而促進骨修復與血管新生，起到延緩股骨頭壞死疾病進程的作用，對治療早中期股骨頭壞死效果尤佳，且毒副作用小、價格低廉。


圖1為顯微鏡下#時四組動物股骨頭組織中Brdu免疫組織化學染色結果，A偽手術組、B模型組、C活骨組、D本發明組。圖2為顯微鏡下#時四組動物股骨頭組織中SDF-I免疫組織化學染色結果，A偽手術組、B模型、C活骨組、D本發明組。圖3為顯微鏡下#時四組動物股骨頭組織病理形態學變化，A偽手術組、B模型組、C活骨組、D本發明組。圖4為顯微鏡下#時四組動物股骨頭組織中BMP2原位雜交檢測結果，A偽手術組、B模型組、C活骨組、D本發明組。圖5為顯微鏡下#時四組動物股骨頭組織中VEGF免疫組織化學染色結果，A偽手術組、B模型組、C活骨組、D本發明組。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1含引經藥牛膝的中藥組合物(水煎劑)及其製備方法牛膝15 黃芪30 當歸15 川芎15赤芍12 桃仁15 紅花15 地龍15桂枝15 木瓜15 威靈仙15按處方量稱重上述原料藥並混合，向原料藥中加5倍重量的水，浸泡1. 5小時後， 煎煮30分鐘，過濾；藥渣再加3倍重量的水，煎煮20分鐘，過濾；合併兩次濾液，製成水煎劑。
實施例2含引經藥牛膝的中藥組合物(水煎劑)及其製備方法牛膝10 黃芪15 當歸10 川芎10赤芍6 桃仁10 紅花10 地龍10桂枝10 木瓜10 威靈仙10按處方量稱重上述原料藥並混合，向原料藥中加5倍重量的水，浸泡1. 5小時後， 煎煮30分鐘，過濾；藥渣再加3倍重量的水，煎煮20分鐘，過濾；合併兩次濾液，製成水煎劑。實施例3含引經藥牛膝的中藥組合物(水煎劑)及其製備方法牛膝20 黃芪45 當歸20 川芎20赤芍18 桃仁20 紅花20 地龍20桂枝120 木瓜20 威靈仙20按處方量稱重上述原料藥並混合，向原料藥中加7倍重量的水，浸泡1小時後，煎煮30分鐘，過濾；藥渣再加5倍重量的水，煎煮20分鐘，過濾；合併兩次濾液，製成水煎劑。實施例4含引經藥牛膝的中藥組合物(丸劑)及其製備方法1、按處方量稱重下述原料藥牛膝15 黃芪30 當歸15 川芎15赤芍12 桃仁15 紅花15 地龍15桂枝15 木瓜15 威靈仙152、製備方法(1)將牛膝、川芎、木瓜、桂枝、威靈仙研磨成粗粉，用80%乙醇回流提取2次，料液重量比為1 20，提取液減壓濃縮，乾燥得浸膏。(2)將地龍打粉，過100目篩，備用。(3)向赤芍、桃仁、紅花中加入10倍重量的純化水，回流提取，提取液減壓濃縮，幹
燥得浸膏。(4)當歸和黃芪用6倍重量的水煎煮提取3次，每次2小時，提取液醇沉，沉澱真空乾燥，得到的藥渣再以8倍重量的70%乙醇提取2次，每次1.證，提取液濃縮乾燥，得浸膏。(5)將⑴、(3)和(4)中得到的浸膏與地龍細粉混勻。(6)以水或黃酒、醋為黏合劑，泛製法製成水丸劑。(7)以煉蜜為黏合劑，製成蜜丸。實施例5含引經藥牛膝的中藥組合物(膠囊劑)及其製備方法1、按處方量稱重下述原料藥牛膝15 黃芪30 當歸15 川芎15赤芍12 桃仁15 紅花15 地龍15桂枝15 木瓜15 威靈仙152、製備方法(1)將牛膝、川芎、木瓜、桂枝、威靈仙研磨成粗粉，用80%乙醇回流提取2次，料液重量比為1 20，提取液減壓濃縮，乾燥得浸膏。(2)將地龍打粉，過100目篩，備用。(3)向赤芍、桃仁、紅花中加入10倍重量的純化水，回流提取，提取液減壓濃縮，乾燥得浸膏。(4)當歸和黃芪用6倍重量的水煎煮提取3次，每次2小時，提取液醇沉，沉澱真空乾燥，得到的藥渣再以8倍重量的70%乙醇提取2次，每次1.證，提取液濃縮乾燥，得浸膏。(5)將(1)、(3)和(4)中得到的浸膏與地龍細粉混合，加入1 1 3(重量比) 的澱粉、糊精或乳糖等輔料，混勻，制粒，裝膠囊，即得。實施例6含引經藥牛膝的中藥組合物(顆粒劑)及其製備方法1、按處方量稱重下述原料藥牛膝15 黃芪30 當歸15 川芎15赤芍12 桃仁15 紅花15 地龍15桂枝15 木瓜15 威靈仙152、製備方法(1)將牛膝、川芎、木瓜、桂枝、威靈仙研磨成粗粉，用80%乙醇回流提取2次，料液重量比為1 20，提取液減壓濃縮，乾燥得浸膏。(2)將地龍打粉，過100目篩，備用。(3)向赤芍、桃仁、紅花中加入10倍重量的純化水，回流提取，提取液減壓濃縮，幹
燥得浸膏。(4)當歸和黃芪用6倍重量的水煎煮提取3次，每次2小時，提取液醇沉，沉澱真空乾燥，得到的藥渣再以8倍重量的70%乙醇提取2次，每次1.證，提取液濃縮乾燥，得浸膏。(5)將(1)、(3)和(4)中得到的浸膏與地龍細粉混合，加入1 1 3(重量比) 的澱粉、糊精或乳糖等輔料，混勻，制粒，即得。實施例7含引經藥牛膝的中藥組合物(衝劑)及其製備方法1、按處方量稱重下述原料藥牛膝15 黃芪30 當歸15 川芎15赤芍12 桃仁15 紅花15 地龍15桂枝15 木瓜15 威靈仙152、製備方法(1)將牛膝、川芎、木瓜、桂枝、威靈仙研磨成粗粉，用80%乙醇回流提取2次，料液重量比為1 20，提取液減壓濃縮，乾燥得浸膏。(2)將地龍打粉，過100目篩，備用。(3)向赤芍、桃仁、紅花中加入10倍重量的純化水，回流提取，提取液減壓濃縮，幹
燥得浸膏。(4)當歸和黃芪用6倍重量的水煎煮提取3次，每次2小時，提取液醇沉，沉澱真空乾燥，得到的藥渣再以8倍重量的70%乙醇提取2次，每次1.證，提取液濃縮乾燥，得浸膏。(5)將(1)、(3)和(4)中得到的浸膏與地龍細粉混合，加入1 1 3(重量比) 的澱粉、糊精或乳糖等輔料，混勻，製成粉劑或顆粒狀衝劑。實驗例含引經藥牛膝的中藥組合物在促進骨髓幹細胞歸巢和治療股骨頭壞死中的應用1材料實施例1的水煎劑(水浴加熱濃縮至含生藥lg/mL)、健康成年日本大耳白兔(北京維通利華實驗動物技術有限公司)。
2方法與結果2. 1 方法2. 1. 1模型製備和給藥採用液氮冷凍左側股骨頭方法建立兔股骨頭壞死模型，造模後將其隨機分為3 組，並設立偽手術對照。造模後各組動物給予皮下注射G-CSF 30yg/kg*d，連續7天，同時分別給予實施例1的水煎劑(本發明組)、活骨湯(實施例1不含牛膝)水煎劑(活骨組) 及蒸餾水(模型組、偽手術組)。2. 1. 2動員骨髓幹細胞與幹細胞歸巢指標檢測各組動物於皮下rhG-CSF注射前、注射後3、5、7天分別檢測外周血白細胞計數，觀察不同時間點白細胞數量的變化趨勢，以間接反應骨髓幹細胞的動員情況。取材前3天所有實驗動物腹腔注射BrdU50mg/kg，連續3天。給藥2w和#後，每組4隻動物處死取左側股骨頭，4%多聚甲醛固定、鹽酸甲酸溶液脫鈣、梯度酒精脫水，常規石切片。免疫組織化學染色檢測BrdU和SDF-I的表達，以觀察對骨髓幹細胞歸巢的作用。2. 1. 3對股骨頭壞死兔的治療作用上述組織，分別採用H E染色股骨頭組織病理學觀察，以鑑定本發明中藥組合物對股骨頭壞死兔的治療作用。2. 1. 4對股骨頭壞死兔骨修復的影響動物處死前取血，分離血清，ELISA法檢測血清骨鈣素(BGP)的水平，上述骨組織切片，經原位雜交檢測股骨頭BMP2的表達，以確定股骨頭骨修復的情況。2. 1. 5對股骨頭壞死兔血管新生的影響上述骨組織切片，經免疫組織化學檢測股骨頭VEGF的表達，以明確股骨頭血管新生的情況。2. 2 結果2. 2. 1幹細胞動員情況G-CSF是一種常用的骨髓幹細胞動員劑，它可將骨髓幹細胞動員後，釋放到外周血。因此常用外周血細胞計數來評價其動員情況。本發明中，採集各組動物注射rhG-CSF 前和注射後3、5、7天靜脈血，通過測量血細胞數量，主要是白細胞數量，來觀察不同時間點骨髓幹細胞的動員情況，結果如表1所示。表1 rhG-CSF對各組動物外周WBC計數的影響
權利要求
1.一種用於促進骨髓幹細胞歸巢的含引經藥牛膝的中藥組合物，其特徵在於，所述中藥組合物由如下重量份的原料藥製成牛膝10 20、黃芪15 45、當歸10 20、川芎10 20、赤芍6 18、桃仁10 20、紅花10 20、地龍10 20、桂枝10 20、木瓜10 20和威靈仙10 20。
2.根據權利要求1所述的中藥組合物，其特徵在於，所述中藥組合物由如下重量份的原料藥製成牛膝12 18、黃芪20 40、當歸12 18、川芎12 18、赤芍9 15、桃仁 12 18、紅花12 18、地龍12 18、桂枝12 18、木瓜12 18和威靈仙12 18。
3.根據權利要求2所述的中藥組合物，其特徵在於，所述中藥組合物由如下重量份的原料藥製成牛膝15、黃芪30、當歸15、川芎15、赤芍12、桃仁15、紅花15、地龍15、桂枝15、 木瓜15和威靈仙15。
4.根據權利要求1-3任一項所述的中藥組合物，其特徵在於，其為口服製劑。
5.根據權利要求4所述的中藥組合物，其特徵在於，所述口服製劑為水煎劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、衝劑或口服液。
6.根據權利要求5所述的中藥組合物，其特徵在於，所述水煎劑的製備方法為將原料藥加5 7倍重量的水，浸泡1 1. 5小時，然後煎煮30分鐘，過濾；藥渣再加3 5倍重量的水，煎煮20分鐘，過濾；合併兩次濾液，製成水煎劑。
7.權利要求1-6任一項所述的中藥組合物在製備促進骨髓幹細胞歸巢藥物中的應用。
8.權利要求1-6任一項所述的中藥組合物在製備治療股骨頭壞死藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種用於促進骨髓幹細胞歸巢的含引經藥牛膝的中藥組合物，所述中藥組合物由如下重量份的原料藥製成牛膝10～20、黃芪15～45、當歸10～20、川芎10～20、赤芍6～18、桃仁10～20、紅花10～20、地龍10～20、桂枝10～20、木瓜10～20、威靈仙10～20。本發明提供的含引經藥牛膝的中藥組合物具有促進自體骨髓幹細胞歸巢的作用，從而促進股骨頭內骨修復與血管再生，對延緩股骨頭壞死等骨關節疾病的病情發展具有顯著效果，且毒副作用小，價格低廉。
文檔編號A61K35/64GK102423351SQ20111015425
公開日2012年4月25日 申請日期2011年6月9日 優先權日2011年6月9日
發明者孔祥英, 林娜, 王榮田, 田能, 陳衛衡 申請人:中國中醫科學院中藥研究所