一種用於轉基因大豆、玉米和棉花檢測的標準質粒分子及其構建的製作方法

2023-06-09 07:23:26 2

專利名稱：一種用於轉基因大豆、玉米和棉花檢測的標準質粒分子及其構建的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種分子生物學技術領域的質粒分子，具體來說，涉及一種轉基因大豆、玉米和棉花檢測用標準質粒分子及其構建方法。
背景技術：
自從轉基因植物商業化以來，全球轉基因植物種植面積不斷擴大，1996年到2009 年全球轉基因農作物種植面積累計達到6. 9億公頃，10多年間轉基因農作物種植面積增長了 67倍。種植的轉基因作物主要是轉基因大豆、轉基因玉米和轉基因棉花。轉基因大豆的種植面積最大，5860萬公頃，佔全球轉基因作物種植面積的57%，其次是轉基因玉米(2520 萬公頃，佔25% )和轉基因棉花(1340萬公頃，佔13% )。隨著轉基因作物的廣泛種植，其安全性問題引起了全球公眾的普遍重視。在許多國家特別是歐洲聯盟，國家立法要求對轉基因產品進行標籤說明。我國於2001年5月23日發布了《農業轉基因生物安全管理條例》，2002年1月5 日公布了農業轉基因生物安全評價、標識和進口安全管理二個配套管理辦法，確定了第一批實施標識管理的農業轉基因生物目錄，並於2002年3月20日起正式實施。標識制度的實施依賴於轉基因產品檢測技術。目前，國際上還沒有統一的轉基因作物及其產品的標準化檢測方法。綜合各國的檢測方法，主要有兩種類型，即基於外源基因表達產物-蛋白質檢測和基於外源基因插入的DNA檢測。針對插入的外源DNA序列，PCR方法應用最廣。PCR檢測策略可以分為四種，即通用元件篩選檢測、基因特異性檢測、構建特異性檢測和品系特異性檢測。通用元件篩選PCR檢測主要是以轉基因通用元件CaMV35S啟動子和NOS終止子為目的基因片段；基因特異性PCR檢測是以插入外源基因的特異性DNA片段作為目的檢測片段；品系特異性PCR檢測是通過檢測外源插入載體與植物基因組的連接區序列實現的。由於每一個轉基因植物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區序列，並且連接區序列是單拷貝，所以品系特異性檢測方法具有較高的特異性和準確性。品系特異性檢測已經成為目前轉基因檢測研究的重點，並逐步地為國際各檢測實驗室所採用。在應用PCR檢測轉基因產品時，需要設置陽性對照來對檢測活動進行監控。通常以從陽性標準品(CRMs)中提取的基因組DNA作為陽性對照，但由於轉基因作物存在生物安全性和和現有技術的限制，轉基因作物陽性標準品很難獲得，因此亟需研製新型陽性對照材料，以滿足不斷發展的轉基因檢測需求。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種轉基因大豆、玉米和棉花檢測用標準質粒分子及其構建方法，使其可以代替陽性標準物質用於轉基因大豆、玉米和棉花的定性和定量PCR檢測。利用融合PCR技術的原理設計了玉米Hmg基因、轉基因玉米Btl76和MonSlO品系的3'端轉化事件的PCR融合引物，經過融合PCR擴增獲得了二基因的融合片段。利用分了克隆技術將融合片段插入到質粒分子PTLE8(專利申請號 201010286884.幻，獲得了組質粒分子pTLHIO。本發明構建的標準質粒分子pTLHIO可以作為檢測過程中的陽性對照，為解決轉基因作物檢測中標準物質缺乏的難題提供一條有效途徑並能有效地保障檢測工作的進行。本發明是通過以下實驗方案實現的，本發明所述標準質粒分子，以替代轉基因大豆品系GTS40-3-2和轉PAT大豆、轉基因玉米Bt 176和Mon810品系、轉基因Bt棉，用於定性和定量PCR檢測。該標準質粒分子含有大豆內參基因LeCtinl、35S啟動子、NOS終止子、 PAT基因、轉基因大豆GTS40-3-2品系的5'端轉化事件序列、棉花內源基因Sad特異性片段、轉Bt基因棉花的外源基因CrylAb/c融合基因的特異性片段、玉米內參基因Hmg特異性片段、轉基因玉米Btl76品系的3'端轉化事件和MonSlO品系的3端轉化事件特異性片段的部分序列。本發明所述的一種轉基因大豆、玉米和棉花檢測用標準質粒分子及其構建方法， 包括以下步驟(1)利用GcnBank資料庫查找並獲得玉米內參基因Hmg、轉基因玉米Btl76品系的 3'端轉化事件和MonSlO品系的3'端轉化事件特異性序列；(2)利用Primer Premier 5. O軟體設計PCR特異性引物並進行blast驗證；(3)分別擴增上述三個基因；(4)採用融合PCR方法將三個基因拼接成一個片段；第一輪反應以轉基因玉米Btl76和Mon810的基因組DNA為模板，以權利要求 3中對應引物進行PCR擴增；反應體系為總體積為50 μ 1，其中10倍Taq緩衝液5 μ 1， dNTPs(10mM)4y 1，上下遊引物(10 μ M)各 2μ 1，模板(IOOng/μ 1) 1 μ 1，用 ddH20 補足至 50 μ 1。反應程序為95"C 5min ；30 個循環(94 "C 30s, 58. 2-59. 6 "C 30s, 72 "C 60s)； 72°C IOmin ；4°C保存；產物標記為 PHmg、PBt、PM。n ；第二輪反應，分兩步進行擴增第一步取第一輪反產物各70ng，10倍Taq緩衝液5 μ 1，dNIPs (IOmM) 4 μ 1，用 (MH2O 補足至 50 μ 1 ；使 PHmg、Pbo PMon 相連接；反應程序11個循環(94°C 15s，60°C 20s，72°C 10min)，4°C保存；第二步向第一步反應液中分別加入引物Bt-Pl和Hmg-P2各1 μ 1 ；反應程序94°C3min,28 個循環(94°C 15s，60°C lmin，72°C 2min)，4°C保存；將融合PCR產物割膠純化後標記為PBH3。(5)因收純化PBH13，連接於pMD 19-TSimple載體，轉入大腸桿菌T0P10篩選得到中間質粒分子PTBH3。(6)將質粒分子pTLE8和pTBH3分別用限制性內切酶EcoR I和)(bal進行雙酶切， 回收這兩種酶切產物，用T4DNA連接酶連接獲得質粒分子pTLHIO。(7)標準質粒分子pTLHIO的定量PCR檢測方法驗證。所述的定量PCR驗證，是指用定量PCR方法分析構建的標準質粒分子pTLHIO中玉米內源基因HmgI和轉基因玉米Btl76、Mon810品系轉化事件特異性序列的定量檢測極限以及重複性和重演性等特性，以鑑定該標準質粒分子代替陽性標準物質的能力本發明有益結果在於，利用融合PCR、酶切、連接等分子克隆技術構建了含有十個基因的標準質粒分子pTLHIO。此標準質粒分子可以代替陽性標準物質用於轉基因大豆、玉米和棉花的定量PCR檢測，很好的解決了檢測過程中陽性標註物質缺乏的問題，在檢測過程中無需提供多種陽性基因組DNA作為陽性對照；將該標準質粒分了轉入大腸桿菌，可長其穩定保存；也可以在原有標準質粒分子的基礎上加入新的外源基因片段，以滿足日益增多的轉基因作物材料檢測的需要。此標準質粒分子PTLHlO在實際檢測中具有較高的特異性和重複性、靈敏度高等優點，應用該標準質粒分子進行實際樣品定量分析時，樣品檢測結果的偏差在國際上廣泛認可的允許範圍內。因此，本發明中構建的標準質粒分子PTLHlO完全適用於對轉基因大豆、玉米和棉花及其加工產品中的轉基因成分含量的定量分析。


附圖為十基因標準質粒分子pTLHIO的測序結果斜體加粗的為融合PCR引物，在十基因之間引入了四個限制性內切酶NotI，Sail， EcoR I和)(ba I。方框內為定量PCR的引物和探針序列。
具體實施例方式為了更充分的解釋本發明的實施，提供轉基因大豆、玉米和棉花標準分子對照物的製備實施實例。這些實施實例僅僅是解釋而不是限制分發明的範圍。下列實施例中未標明具條件的實驗方法，通常按照常規條件操作實施例1 標準質粒分子的構建一、實驗材料轉基因玉米Btl76品系和Mon810品系；非轉基因玉米品種。二、實驗試劑pMD 19-T Simple Vector購自大連寶生物工程公司；dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA marker I、II和marker III購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶Not I.Sal I、EcoR I, Xba I購自NEB北京有限公司；質粒基因組DNA提取及純化採用北京天根生化科技有限公司研製的質粒小量提取試劑盒；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。三、實驗儀器TC-512型PCR擴增儀(英國TECHNE公司)；Geliance 200DNA電泳凝膠成像儀 (美國PerkinElmer公司)；Nano-Drop ND-1000核酸蛋白儀(美國Nano Drop公司)；離心機；恆溫水浴鍋；培養箱；天平等。四、試驗方法和過程1、植物基因組DNA提取-SDS法a、稱取0. Ig經粉碎機粉碎的玉米樣品，加入Iml 65°C預熱的2% SDS抽提液， 10 μ IRNase-A混勻，於65°C溫育30min，置於室溫後13000r離心lOmin。b、取上清加0. 6倍體積的KAc，冰浴20min後，13000r離心lOmin，取上清加2倍體積預冷無水乙醇，混勻。c、於-20°C靜置30min，13000r離心lOmin，充上清，沉澱用70%乙醇洗滌，短時間離心後棄上清，重複一次。自然乾燥後加200μ1 TE溶沉澱，20°C保存。d、取2 μ 1提取的DNA樣品，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量。利用核酸儀測定所提取的DNA濃度和純度。2、引物設計在GenBank中搜索玉米內源基因Hmg、轉基因玉米Btl76品系和Mon810品系的3 『 端轉化事件特異性序列，利用軟體ft~imer5. 0設計3對定性PCR引物，分別用於擴增玉米內參基因特異性序列Hmg、轉基因玉米Btl76品系和MonSlO品系的3'端轉化事件特異性序列。具體引物序列見表1。表1構建標準質粒分子的PCR引物序列
權利要求
1.一種轉基因大豆、玉米和棉花檢測用標準質粒分子，其特徵在於，含有大豆內參基因Lectin 1、35S啟動子、NOS終止子、PAT基因、轉基因大豆GTS40-3-2品系的5'端轉化事件35SG、棉花內源基因Sad特異性片段、轉Bt基因棉花的外源基因CrylAb/c融合基因的特異性片段、玉米內參基因Hmg特異性片段、轉基因玉米Btl76品系的3'端轉化事件和MonSlO品系的3'端轉化事件特異性片段的部分序列，其先後順序為Lectin l+35S+N0S+PAT+35SG+Sad+Cryl Ab/c+Bt176+Mon81O+Hmg
2.根據權利要求1所述的轉基因大豆、玉米和棉花檢測用標準質粒分子，其特徵是，所述的大豆內源基因Lectin、棉花內源基因Sad和玉米內源基因Hmg，分別指的是大豆凝集素基因、硬脂醯-醯基載體蛋白脫飽和酶基因和玉米內生高遷移率族基因，其在大豆、玉米和棉花基因組中高度保守，具有種間特異性、種內非特異性和單拷貝數的特點；所述的篩選序列35S是指花椰菜花葉病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV) 35S啟動子；所述的NOS是指根癌農桿菌胭脂鹼合成酶基因(N0Q終止子；所述的PAT基因是指草丁膦乙醯轉移酶基因(PAT)；所述的轉基因大豆GTS40-3-2品系的5'端轉化事件35SG是指外源插入載體與大豆基因組的連接區序列；所述的CrylAb/c是指殺蟲晶體蛋白CrylAb、CrylAc基因的融合基因(CrylAb/c)；所述的轉基因玉米Btl76品系3 『端轉化事件是指外源插入載體與玉米基因組的連接區序列；所述的轉基因玉米MonSlO品系3'端轉化事件是指外源插入載體與玉米基因組的連接區序列。
3.根據權利要求1所述的轉基因大豆、玉米和棉花檢測用標準質粒分子，其中轉基因玉米Btl76品系的3'端轉化事件、MonSlO品系的3'端轉化事件和玉米內參基因Hmg特異性序列的引物序列如下13標基W引物…物序列(5'-3')產物人小(bp)Btl 76Bt-PlGGAATTCGAAGTCCCTGGAGGCACABt-P2AGGTCTTGGCTGTCTTC-ACTCCGTGGGCGTGGTAT372Mon810Mon-PlATACCACGCCCACGGAGT-GAAGACAGCCAAGACCTMon-P2AAAGTCAAAGTAGATACrT-TTACATCTAAGAAGGATTCTCA365HmgHmg-PlrGAGAA'I'CC'n'CrrAGAI'GrAA-ACTATCTACTTTGACTTTHmg-P2GCTCTAGA GAAGCATCAGTTTCCCTACC.354
4. 一種如權利要求1所述的轉基因大豆、玉米和棉花檢測用標準質粒分子的構建方法，其特徵在於，包括以下步驟第一輪反應以轉基因大豆Btl76品系、轉基因玉米MonS 10品系基因組DNA為模板，以權利要求3中對應引物進行PCR擴增；反應體系為總體積為50μ 1，其中10倍Taq緩衝液 5 μ 1，dNTPs(10mM)4y 1，上下遊引物(10 μ M)各 2μ 1，模板(IOOng/μ 1) 1 μ 1，用 ddH20 補足至50 μ 1。反應程序為95 "C 5min ；30 個循環(94 "C 30s, 58. 2-59. 6 "C 30s, 72 "C 60s)； 72°C IOmin ；4°C保存；產物標記為 PHmg、PBt、PM。n ； 第二輪反應，分兩步進行擴增第一步取第一輪反應產物各70ng，10倍Taq緩衝液5μ l，dNTPs(10mM)4y 1，用ddH20 補足至50 μ 1 ；使PHmg、PBt、PMon相連接；反應程序11 個循環(94°C 15s，60°C 20s, 72°C 10min)，4°C保存；第二步向第一步反應液中分別加入引物Bt-Pl和Hmg-P2各1μ 1 ； 反應程序94°C 3min,28 個循環(94°C 15s，60°C lmin，72°C 2min)，4°C保存；將融合 PCR產物割膠純化後標記為PBH3。將融合純化產物Pbh3連接於pMD 19-T Simple載體，轉入大腸桿菌T0P10篩選得到中間質粒分子PTBH3。將質粒分子pTLE8和pTBH3分別用限制性內切酶EcoR I和)(ba I進行雙酶切，分別回收酶切目的片段BH3和pTLE7，用T4DNA連接酶連接獲得質粒分子pTLHIO。
全文摘要
本發明公開了一種轉基因作物檢測中必要的標準質粒分子及其構建方法。將八基因質粒分子pTLE8(專利申請號201010286884.3)進行改造，增加轉基因玉米Bt176品系和Mon810品系的3′端轉化事件特異性序列和玉米內參基因Hmg特異性序列的融合片段，改造成十基因的質粒分子pTLH10(Lec1，35S，NOS，PAT，Sad1，Cry1Ab/c，Bt176，Mon810和Hmg)。本發明中構建的標準質粒分子完全可以代替陽性標準品，適用於對轉基因大豆GTS40-3-2品系、轉基因玉米Bt176和Mon810品系及轉Bt基因棉花的篩選、基因特異性和品系特異性的定性和定量PCR分析和檢測。
文檔編號C12N15/63GK102559854SQ201010595049
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月20日 優先權日2010年12月20日
發明者楊雅麟, 滕達, 王建華, 王秀敏 申請人:中國農業科學院飼料研究所