一種功能性稀土配合物長壽命螢光染料及其合成方法和應用的製作方法

2023-06-09 07:03:31 1

專利名稱：一種功能性稀土配合物長壽命螢光染料及其合成方法和應用的製作方法
技術領域：
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本發明涉及一種功能性稀土配合物長壽命螢光染料，還涉及該螢光染料的合成方法和 應用。
背景技術：
稀土配合物染料是近二十幾年發展起來並受到重視的一類長壽命螢光化合物。它的熒 光具有非常特殊的三價稀土離子配合物的光譜特性，例如線狀譜線和大的斯託克斯位移，
這在基於螢光的生物探測中，為獲得低探測下限和高靈敏度具有重要的意義。特別是長的 螢光壽命(毫秒到微秒的範圍)，利用時間分辨檢測技術可以消除背景螢光(微秒量級以 下)對探測信號的影響。
生物標記是生物傳感研究中的關鍵技術，螢光標記易受生物體系內源螢光背景幹擾、 靈敏度相對較低、信號易受環境影響。長壽命螢光可利用時間分辨的方法消除樣品中螢光 背景的幹擾。經過修飾上特定的活性基團的染料在分析化學、生命科學、環境科學以及其 他領域具有極大的應用價值。目前人們己經對稀土離子的螢光進行了深入的研究，廣泛探 討了其螢光機理、螢光特點和影響因素。近年來，國內外學者把稀土配合物的螢光應用到 生物化學的研究領域，將稀土離子螢光檢測高靈敏度性和生物抗原抗體反應的高特異性、 分子生物學核酸探針高度專一性有機地結合起來創造了新的超微量檢測生物活性物質的 分析技術。但是在母體染料上引入活性官能團進而用於生物標記以及生物分析檢測等領域 仍然是一個難點
發明內容
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本發明的目的之一是提供一種母體染料上具有功能性基團的稀土配合物長壽命螢光 染料；目的之二是提供該稀土配合物長壽命螢光染料的合成方法；目的之三是提供該稀土 配合物長壽命螢光染料的應用。
本發明的目的之一可通過如下技術措施來實現
所述的稀土配合物具有以下式I所示的結構式其中M=Eu或Tb
式I 。formula see original document page 4
式I所示的結構式中具有功能性反應基團；所述的功能性反應基團為氨基。 本發明的目的之二可通過如下技術措施來實現
以噻吩甲醯三氟丙酮、5-氨基-l，10-鄰菲餵啉為配體製備長壽命螢光稀土配合物，將稀 土氯化物的乙醇溶液和三氟乙醯丙酮的乙醇溶液加入混合，控制溫度為55°C-65°C，用調 節pH值5.5-6.5，反應30-50min;將5-氨基-l,10-鄰菲囉啉的乙醇溶液滴加至反應體系中， 控制反應溫度在55-65'C繼續反應4-6h，攪拌冷卻，靜置過夜，有白色的固體析出，抽濾; 先用乙醇水溶液洗滌，再用蒸餾水洗滌，乾燥，以甲醇-氯仿混合溶液重結晶兩次，得產品。 所述的5-氨基-l，10-鄰菲囉啉由下述方式製得以1,10-鄰菲餵啉為原料通過硝化反應制 得5-硝基-l,10-鄰菲囉啉；再通過還原反應製得5-氨基-l,10-鄰菲P羅啉。
所述的硝化反應是以濃硫酸和濃硝酸混合酸為硝化劑，反應時間為2.5-3.5小時;所 述的還原反應是以含鈀質量分數為5%的鈀炭為催化劑，反應時間為4. 5-5. 5小時；
以稀土氧化物為原料製取稀土氯化物，氧化銪用濃鹽酸溶解或氧化鋱用高氯酸溶解。
本發明具體的合成方法主要按如下步驟進行
a、 以1，10-鄰菲囉啉為原料通過硝化反應製取5-硝基-l,10-鄰菲口羅啉，硝化反應是以濃硫酸 和濃硝酸混合酸為硝化劑，反應時間為3小時
b、 以5-硝基-l，10-鄰菲囉啉為原料通過還原反應製取5-氨基-l,10-鄰菲餵啉，還原反應是 以5%鈀炭為催化劑，反應時間為5小時；
c、 以稀土氧化物為原料製取稀土氯化物，稀土氧化物可以為氧化銪用濃鹽酸溶解或氧化 鋱用高氯酸溶解；
d、 以噻吩甲醯三氟丙酮、5-氨基-l,10-鄰菲囉啉為配體製備長壽命螢光稀土配合物。將稀 土氯化物的乙醇溶液和三氟乙醯丙酮的乙醇溶液加入三口燒瓶中，控制溫度為6(TC,用氫 氧化鈉溶液調節pH值6.0左右，反應40min。將5-氨基-l,10-鄰菲囉啉的乙醇溶液滴加至反應體系中。控制反應溫度在55-60'C繼續反應5h，攪拌冷卻。靜置過夜，有白色的固體 析出，抽濾；先用24ml乙醇-水(1: 1)溶液洗漆，再用蒸餾水洗滌，於50'C下乾燥，以 甲醇-氯仿混合溶液重結晶兩次，得產品。
本發明的目的之三可通過如下技術措施來實現
具有式I所示結構式的稀土配合物作為長壽命螢光染料應用於生物分析領域中作為 生物標記。
本發明分別採用不同的反應原料，如氧化銪、氧化鋱為反應物，可以合成出下列染料-
本發明合成的螢光染料具有獨特的長壽命螢光和大的斯託克斯位移，並且化學穩定性 和光穩定性好。該類染料是一種理想的光功能材料。所合成的這類稀土配合物長壽命螢光 染料中都含有氨基，可以以氨基作為活性官能團與寡核苷酸片斷或生物大分子如免疫球蛋 白IgG等共價聯接構建長壽命螢光探針，這在基於螢光的生物探測中，為獲得低探測下限 和高靈敏度具有重要的意義。
本發明主要合成了一種新的功能性稀土配合物的長壽命螢光染料，這類化合物中都含 有活性官能團氨基，該活性官能團的引入可以使其比較容易的跟別的化合物反應，進而更 廣泛的用於生物標記和生物分析之中。


圖1為Eu(TTA)3phen納米顆粒的長壽命發光發射光譜；
formula see original document page 5
圖2為Tb(TTA)3phen納米顆粒的長壽命發光發射光譜; 圖3為三明治結構的檢測模型雜交示意圖； 圖4玻片上檢測長壽命發光光譜。
具體實施例方式
以下實施例旨在說明本發明而不是對本發明的進一步限定。
實施例1:
以噻吩甲醯三氟丙酮、5-氨基-l，10-鄰菲囉啉為配體的稀土銪配合物的製備，其步驟為: a、以1,10-鄰菲囉啉為原料製取5-硝基-l，10-鄰菲囉啉，通過以下反應合成
formula see original document page 6
在三口燒瓶中加入5.00g 1,10-鄰菲囉啉，並往三口燒瓶中加入7.5ml濃硫酸，使二者 混合均勻，繼續攪拌，油浴加熱，分別移取15ml濃硫酸和15ml濃硝酸的混合物於恆壓滴 液漏鬥中，在加熱攪拌的情況下緩慢滴加該混合物，溫度不超過170'C，反應3h，冷卻至 室溫，將反應液倒入已經準備好的冰水中，用10%的氫氧化鈉溶液調節pH至6.0左右， 即有黃色物質析出；抽濾，並用水洗，放置在乾燥箱中乾燥，再經乙醇重結晶，乾燥得黃 色產物5-硝基-l，10-鄰菲餵啉。
b、以5-硝基-l,10-鄰菲囉啉為原料製取5-氨基-l，10-鄰菲囉啉，通過以下反應合成
formula see original document page 6
在三口瓶中依次加入1.50g 5-硝基-l，10-鄰菲囉啉和300mg 5%鈀炭催化劑，加入乙醇 攪拌，水浴加熱。當溫度達到55。C-70。C時，加入已經配好的水合肼的乙醇溶液，回流反 應5h;趁熱過濾，再用乙醇洗滌數次，濾液旋轉蒸發除去大部分的乙醇，冷卻，即析出淡 黃色固體，抽濾，乾燥，再用乙醇重結晶，得黃色針狀產物5-氨基-l,10-鄰菲囉啉。
c、以氧化銪為原料製取氯化銪，通過以下反應合成
Eu203 + HC1 - EuCl3.6H20
稱取175.96mg氧化銪於0.5ml濃鹽酸中，加熱溶解，除去多餘的濃鹽酸，加乙醇稀 釋得透明溶液。
d、以噻吩甲醯三氟丙酮、5-氨基-l,10-鄰菲卩羅啉、氯化銪為原料製取稀土銪配合物， 通過以下反應合成formula see original document page 7
以15ml乙醇溶解666.54mg噻吩甲醯三氟丙酮。將氯化銪的乙醇溶液和噻吩甲醯三氟 丙酮的乙醇溶液徐徐加入到三口瓶中，水浴加熱，磁力攪拌，控制溫度為60。C,用氫氧化 鈉溶液調節pH值6.0左右，反應40min。以10ml乙醇溶解195.2mg 5-氨基-l，10-鄰菲囉啉， 滴加至反應體系中。控制反應溫度在55-60'C繼續反應5h，攪拌冷卻。靜置過夜，有白色 的固體析出，抽濾。先用24ml乙醇-水(1: 1)溶液洗滌，再用蒸餾水洗滌，於50'C下幹 燥，以甲醇-氯仿混合溶液重結晶兩次，得白色產物以噻吩甲醯三氟丙酮、5-氨基-1,10-鄰菲餵啉為配體的稀土銪配合物。在激發波長為412nm、激發和發射狹縫分別為2.5nm、 延遲時間為O.lms和門時間為l.Oms時，掃描一定量配合物固體的發射光譜，如圖1所示， 該配合物在611nm處出現了發射峰，表現出了長壽命的螢光。紅外光譜檢測該配合物數據 自由配體TTA中1637cm"的v(c^o)特徵峰,在配合物中藍移到了 1626 cm'1;自由配體phen 位於1587cm—1處v(c = n)的特徵峰，在配合物中藍移到了 1550 cm'1 。元素分析
EuC36H24N3F9S3:測量值Eu， 15.13; C， 42.58; H， 2.31; N， 4.19;計算值Eu， 14.99; C， 42.62; H， 2.37; N， 4.14;
實施例2:
以噻吩甲醯三氟丙酮、5-氨基-l,10-鄰菲囉啉為配體的稀土鋱配合物的製備，其步驟為:
a、 以1，10-鄰菲囉啉為原料製取5-硝基-l,10-鄰菲口羅啉，同實施例l。
b、 以5-硝基-l，10-鄰菲囉啉為原料製取5-氨基-l,10-鄰菲餵啉，同實施例l。
c、 以氧化鋱為原料製取氯化鋱，通過以下反應合成 Tb407 + HC104 ~~ Tb(C104)3. 6H20
稱取123.27mg氧化鋱於高氯酸中，加熱溶解，除去多餘的高氯酸，加乙醇稀釋得透 明溶液。
d、 以噻吩甲醯三氟丙酮、5-氨基-l，10-鄰菲囉啉、氯化鋱為原料製取稀土鋱配合物， 通過以下反應合成
formula see original document page 8
以15ml乙醇溶解440.60mg噻吩甲醯三氟丙酮。將氯化鋱的乙醇溶液和噻吩甲醯三氟 丙酮的乙醇溶液徐徐加入到三口瓶中，水浴加熱，磁力攪拌，控制溫度為60'C,用氫氧化 鈉溶液調節pH值6.0左右，反應40min。以10ml乙醇溶解130.15mg 5-氨基-l，10-鄰菲囉 啉，滴加至反應體系中。控制反應溫度在55-6(TC繼續反應5h，攪拌冷卻。靜置過夜，有
55 60。C 乙醇中反應3h
深綠色固體析出，抽濾。先用24ml乙醇-水(1: 1)溶液洗滌，再用蒸餾水洗滌，於5(TC 下乾燥，以甲醇-氯仿混合溶液重結晶兩次，乾燥得深綠色固體。在激發波長為344nm、激 發和發射狹縫分別為5.0nm、延遲時間為O.lms和門時間為l.Oms時，掃描一定量配合物 固體的發射光譜，如圖2所示，該配合物在612nm處出現了發射峰，表現出了長壽命的熒 光。紅外光譜檢測該配合物數據自由配體TTA中1637 cm"的v(c-o)特徵峰，在配合物 中紅移到了 1639cm";自由配體phen位於1587cm"處v(c-N)的特徵峰，在配合物中藍移 到了 1550 cm-1。元素分析TbC36H24N2F9S3:測量值Tb， 15.27; C， 42.64; H， 2.29; N， 4.24;計算值Tb， 15.57; C, 42.32; H， 2.35; N， 4.11; 實施例3:
以實施例1中製取的稀土銪配合物標記檢測金色葡萄球菌的DNA3,採用專利(譚蔚 弘、王克敏、龔萍、何曉曉，矽殼納米顆粒檢測SARS病毒基因組片斷的方法，中國專利，
公開日2005年3月23日，公開號CN 1597987A)報導的三明治模型的檢測方法，如圖3 所示。具體步驟
a、玻片的醛基化及修飾有氨基的探針DNAi在玻片表面上的固定，具體步驟(1) 正方形玻片(直徑13mm)浸入鉻酸洗液中浸泡過夜，蒸餾水洗，浸入25%的氨水中過夜， 二次蒸餾水水洗，浸入含2%氨基矽烷試劑的95%乙醇溶液中，用冰醋酸調節pH至4.5， 室溫作用30min，分別用乙醇和二次蒸餾水超聲清洗，室溫晾乾。然後用2.5%戊二醛的 O.lmol/LPBS (pH=7.2)溶液與氨基玻片作用2h，分別用PBS溶液和二次蒸餾水衝洗，晾 幹，得到表明修飾有醛基的玻片。(2)將探針DNAi用二次蒸餾水稀釋到15umol/L，滴加 到醛基化玻片表面，室溫靜置過夜，然後用0.2%的SDS洗2次，水洗兩次，室溫晾乾備 用。
b、稀土銪配合物聯接上修飾有氨基的DNA2，具體步驟稱取100mg稀土銪配合物 分散到6mL 2.5%的戊二醛溶液中，室溫下劇烈震蕩3h。離心並用二次蒸餾水洗，得到的 醛基連接的稀土銪配合物重新懸於6mLpH-7.2的PBS溶液中備用。將探針DNA2用二次 蒸餾水稀釋成15umol/L。將一定量的DNA2樣品加入到納米顆粒懸浮的PBS溶液中，37 t)下于震蕩培養箱中反應3h,反應完成後，離心，洗滌。然後將標記好DNA2的稀土銪配 合物重新分散於PBS緩衝液中。
c、雜交及雜交信號檢測，具體步驟首先將目標探針DNA3用二次蒸餾水稀釋到15umol/L。 將上述DNA!修飾的玻片放入雜交盒中，在玻片周圍滴加10uL3xSSC來維持溼度。將DNA2
和DNA3樣品滴加到玻片上，蓋上蓋玻片，趕走氣泡。蓋上雜交盒，將其放入震蕩培養箱 中恆溫箱(38.3°C)中雜交24h，清洗，真空6(TC乾燥。帶有長壽命螢光配合物標記的識 別DNA2，目標DNA3和捕獲DNA,探針形成雜交體，在雷射激發下產生一個長壽命螢光 信號，實驗結果如下圖所示，實驗中檢測出了玻片上的螢光信號。從圖4可以看出，我們 在玻片上檢測到了稀土銪配合物的長壽命螢光，激發和發射狹縫分別為8.0nm，延遲時間 為O.lms，門時間為1.0 ms。
權利要求
1.一種功能性稀土配合物長壽命螢光染料，其特徵在於，所述的長壽命螢光染料具有式I所示的結構式其中M＝Eu或Tb式I。
2、 合成權利要求1的一種功能性稀土配合物長壽命螢光染料的方法，其特徵在於，以噻 吩甲醯三氟丙酮、5-氨基-l,10-鄰菲餵啉為配體製備長壽命螢光稀土配合物，將稀土氯化物 的乙醇溶液和三氟乙醯丙酮的乙醇溶液加入混合，控制溫度為55'C-65°C，調節pH值 5.5-6.5，反應30-50min;將5-氨基-l,10-鄰菲囉啉的乙醇溶液滴加至反應體系中，控制反應 溫度在55-65。C繼續反應4-6h，攪拌冷卻，靜置過夜，有白色的固體析出，抽濾；先用乙 醇水溶液洗滌，再用蒸餾水洗滌，乾燥，以甲醇-氯仿混合溶液重結晶兩次得產品。
3、 根據權利要求2所述的一種功能性稀土配合物長壽命螢光染料的合成方法，其特徵在 於，所述的5-氨基-l,10-鄰菲餵啉由下述方式製得以1,10-鄰菲餵啉為原料通過硝化反應 製得5-硝基-1,10-鄰菲餵啉；再通過還原反應製得5-氨基-l，10-鄰菲P羅啉。
4、 根據權利要求3所述的一種功能性稀土配合物長壽命螢光染料的合成方法，其特徵在 於，所述的硝化反應是以濃硫酸和濃硝酸混合酸為硝化劑，反應時間為2.5-3.5小時;所 述的還原反應是以含鈀質量分數為5%的鈀炭為催化劑，反應時間為4. 5-5. 5小時；
5、 根據權利要求2所述的一種功能性稀土配合物長壽命螢光染料的合成方法，其特徵在 於，以稀土氧化物為原料製取稀土氯化物，氧化銪用濃鹽酸溶解或氧化鋱用高氯酸溶解。
6、 權利要求1的一種功能性稀土配合物長壽命螢光染料的應用，其特徵在於，具有式I 所示結構式的稀土配合物作為長壽命螢光染料應用於生物分析領域中作為生物標記。
全文摘要
本發明提供了一種功能性稀土配合物長壽命螢光染料及其合成方法和應用，該合成方法以噻吩甲醯三氟丙酮、5-氨基-1，10-鄰菲囉啉為配體製備長壽命螢光稀土配合物。本發明化合物合成方法簡便，具有長的螢光壽命和活性基團氨基，具有極大的應用價值。
文檔編號C09K11/06GK101368005SQ20081014328
公開日2009年2月18日 申請日期2008年9月25日 優先權日2008年9月25日
發明者曾光明, 李慧霞, 牛承崗, 秦品珠, 敏 阮 申請人:湖南大學