人工改造的高活性Mariner-Like轉座酶的製作方法

2023-07-30 12:00:46 1

人工改造的高活性Mariner-Like轉座酶的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種Mariner-Like轉座酶，本發明將毛竹中克隆到的活性轉座酶和對其進行分子優化之後獲得較高活性的植物MLE轉座酶，為利用MLE轉座子開發基因標籤奠定了基礎，為後基因組時代大規模分離和標記基因功能提供了有力保障。
【專利說明】人工改造的高活性Mar iner-Like轉座酶
【技術領域】
[0001]本發明屬於分子生物學【技術領域】,具體而言,涉及幾種高活性Mariner-Like轉座酶。
【背景技術】
[0002]轉座子(transposon)是指在基因組上能從一個位點轉移到另一個位點的一段DNA序列。自20世紀40年代美國遺傳學家McClintock首先在玉米中發現轉座子(Ac/Ds)以來，科學家們發現了多種類型的轉座子，它們廣泛存在於細菌、酵母和高等動植物中。隨著人們在分子水平上對轉座子結構和功能認識的不斷深化，一些轉座子已被改造為基因標籤應用於基因分析，並逐漸成為大規模分離植物基因的重要手段之一。
[0003]Mariner-Like 轉座子(Mariner-Like Elements, MLE)是轉座子中一個重要家族，最早是在研究茅利塔尼亞果蜆(Drosophila mauristiana)白眼基因的一個不穩定突變時發現的。此後在其他動物以及植物基因組中也發現了大量MLE轉座子的存在。與其它轉座子相比較，MLE轉座子具有結構簡單、異源轉座率高、在基因組插入位點接近隨機等特點，使其在開發基因標籤，分離基因，研究基因功能上，遠遠優於其他轉座子。
[0004]MLE轉座子由兩端反向重複序列(Terminal Inverted Repeats, TIRs)和編碼轉座酶的基因組成，轉座酶負責催化轉座子轉座，因此轉座酶的活性是影響轉座子的轉座頻率的主要因素。MLE轉座子具有結構簡單、異源轉座率高、在基因組插入位點接近隨機等特點使其在開發基因標籤，分離基因，研究基因功能上，遠遠優於其他轉座子。然而自然界分離的MLE轉座酶由於在進化過程中「垂直失活」效應積累了或多或少的突變，部分或全部喪失了催化轉座能力，成為低 活性或非活性的轉座酶，嚴重影響了 MLE轉座子的應用，因此人工構建高活性的轉座酶就顯得十分重要。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種高活性Mariner-Like轉座酶，為了實現本發明的目的，擬採用如下技術方案:
[0006]本發明一方面涉及一種Mariner-Like轉座酶,其特徵在於所述的Mariner-Like轉座酶的胺基酸序列為SEQ ID N0.3或者SEQ ID N0.3定點突變所得到的序列，所述的定點突變是指 E65A, G68F, P70V, G73R, E75V, D76Q, A78I, P79W, A83K, A106R, F243R, T253D,T272R 和 / 或 N289R。
[0007]在本發明的一個優選實施方式中，所述的Mariner-Like轉座酶的胺基酸序列為SEQ ID N0.5所表示的胺基酸序列在S253D和E75V同時定點突變的胺基酸序列，以及SEQID N0.6所表示的胺基酸序列在E75V定點突變的胺基酸序列。
[0008]在本發明的另一方面,本發明還涉及上述Mariner-Like轉座酶所對應的核苷酸。
[0009]在本發明的另一方面,本發明還涉及一種Mariner-Like轉座子,其特徵在於所述的Mariner-Like轉座子包括上述核苷酸序列。[0010]在本發明的一個方面，所述的Mariner-Like轉座子的基因序列為SEQ ID N0.1。
[0011]本發明將毛竹中克隆到的高活性轉座酶或對其進行分子優化之後獲得較高活性的植物MLE轉座酶，為利用MLE轉座子開發基因標籤奠定了基礎，為後基因組時代大規模分離和標記基因功能提供了有力保障。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1MLE轉座酶表達載體的構建流程圖:MLE轉座酶插入到表達載體pAG413-gal-ccdB中NotI和EcoRV兩個酶切位點之間，得到重組質粒pAG413_gal_Tpase(Tpase表示轉座酶)。MLE轉座酶由GALl啟動子控制。載體上同時含有抗生素篩選標記基因氨苄黴素(Ampicillin)和組氨酸His篩選標記基因；
[0013]圖2MLE非自主轉座子供體載體的構建流程圖:Ppmar2的非自主性轉座子插入到pWL89a載體的HpaI酶切位點上，得到非自主轉座子供體載體pWL89a_Tn(Tn表示非自主性轉座子)。載體上同時含有抗生素篩選標記基因氨苄黴素(Ampicillin)和尿素(Ura)篩選標記基因，分別由相應的啟動子啟動。載體上還含有腺嘌呤(ADE2)標記基因，非自主性轉座子剛好插在ADE基因內部的HpaI酶切位點上使該基因失活，若非自主性轉座子轉座離開可使ADE2基因恢復表達。
【具體實施方式】
[0014]下面結 合具體實施步驟進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。除非特別指出，下列實例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如Sambrook.等主編的《分子克隆實驗指南》中所述條件，或按照試劑盒陳述的步驟進行操作。
[0015]一、野生型MLE轉座酶和去除轉座酶的非自主性轉座子的獲得
[0016]以新鮮的毛竹葉片(Phyl1stachyspubescens,採集於浙江農林大學植物園，北緯N30° 15' 14.67"東經E119° 43 ^ 33.47 ")為材料，採用CTAB法提取毛竹基因組DNA,根據MLE轉座子TIR保守序列設計引物(Ppmar2-5-3，序列詳細信息見表1)，用該引物在毛竹基因組中擴增得到MLE轉座子的全長Ppmar2 (Ppmar2序列見SEQ.N0.1)，連接到pGEM-TVector (Promega公司)克隆測序。經NetGene2和GenScan生物信息學軟體預測轉座酶的內含子和外顯子，將外顯子拼接，得到剔除內含子的轉座酶編碼序列。Ppmar2轉座酶核苷酸序列和相應的胺基酸序列分別見SEQ.N0.2和SEQ.N0.3。
[0017]將含有毛竹Ppmar2全長序列的pGEM_T載體用HinfI切除Ppmar2中間轉座酶的大部分序列，再將載體自連後分別得到Ppmar2的非自主性轉座子(pGEM-Ppmar2_Tn)。Ppmar2的非自主性轉座子序列見SEQ.N0.4。
[0018]二、酵母轉座表達載體的構建
[0019]1.MLE轉座酶表達載體的構建
[0020]用酶切位點修飾的引物(PpTpase2-5和PpTpase2-3，序列詳細信息見表1)擴增拼接後的Ppmar2轉座酶。分別將Ppmar2轉座酶擴增序列和pAG3_gal_ccdB載體經NotI和EcoRV雙酶切後，將轉座酶酶切產物和pAG413-gal-ccdB載體大片段相連，即轉座酶替換pAG413-gal-ccdB載體中的ccdB,得到重組載體pAG413_gal_Tpase (Tpase表示轉座酶)，流程圖見圖1。該載體具有His (組氨酸)篩選標記,使導入pAG413-gal-Tpase載體的宿主能夠缺乏His的缺失培養基上生長。
[0021]2.MLE非自主轉座子供體載體的構建
[0022]以pGEM-Ppmar2-Tn為模板，利用Ppmar2-5_3引物擴增Ppmar2的非自主性轉座子，同時將載體pWL89a用HpaI酶切(酶切位點位於ADE2基因內)，回收載體骨架。然後用In-FusionAdvantagePCRCloningKit (TaKaRa公司，日本)將非自主性轉座子插入到載體pWL89a的ADE2基因中，導致報告基因ADE2插入失活，得到pWL89a_Tn (Tn表示非自主性轉座子)，載體構建流程請見圖2。若轉座子發生轉座從ADE2基因上離開，那麼ADE2基因閱讀框得到回覆。該載體具有URA3篩選標記，使導入pWL89a-Tn的宿主能夠在缺乏Ura (尿素)的缺失培養基上生長。
[0023]三、共轉化酵母和誘導轉座
[0024]將pAG413_gal_Tpase重組質粒和pWL89a_Tn重組質粒，用PEG/LiAc法共同轉化到酵母中，用His/Ura雙缺固體培養基上進行選擇培養。用半乳糖誘導轉座酶表達，促使非自主轉座子發生轉座。
[0025]四、定點突變MLE轉座酶
[0026]根據Ppmar2轉座酶與其他植物MLE轉座酶進行同源性比對，選取轉座酶關鍵位點的胺基酸進行突變。Ppmar2轉座酶確定了 14個胺基酸突變位點，它們分別是:E65A，G68F，P70V, G73R, E75V, D76Q, A78I, P79W, A83K, A106R, F243R, T253D, T272R, N289R。
[0027]按照QuikChange?Site-DirectedMutagenesisKit (Stratagene 公司，美國)試劑盒說明書，設計定點突變`引物(序列詳細信息見表1)，以pAG413-gal-TpaSe為模板，利用PfuTurbo?DNApolymerase重新合成DNA。然後在合成產物中加入2 μ L的DpnI限制性內切酶，於37°C條件下反應5min，將原始模板序列徹底降解。將酶切後的合成產物轉化大腸桿菌DH5 α，對轉化子進行菌落PCR驗證，並提取質粒測序，對測序正確的質粒保藏備用。
【權利要求】
1.一種Mariner-Like轉座酶，其特徵在於所述的Mariner-Like轉座酶的胺基酸序列為SEQ ID N0.3或者SEQ ID N0.3定點突變所得到的序列，所述的定點突變是指E65A，G68F，P70V, G73R, E75V, D76Q, A78I, P79W, A83K, A106R, F243R, T253D, T272R 和 / 或 N289R。
2.根據權利要求1所述的Mariner-Like轉座酶,所述的Mariner-Like轉座酶的胺基酸序列為SEQ ID N0.3所表示的胺基酸序列為S253D和E75V同時定點突變的胺基酸序列，或者為E75V定點突變的胺基酸序列，分別為SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.6。
3.權利要求1或2所述的Mariner-Like轉座酶所對應的核苷酸序列。
4.一種Mariner-Like轉座子,其特徵在於所述的Mariner-Like轉座子包括權利要求3所述的核苷酸序列。
5.Mariner-Like轉 座子，其基因序列為SEQ ID N0.1。
【文檔編號】C12N9/90GK103602654SQ201310589855
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】周明兵, 湯定欽, 鄭麗娜 申請人:浙江農林大學