一種水溶生物肥料的製作方法
2023-06-08 23:06:16 1
一種水溶生物肥料的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種水溶生物肥料，其活性成分為枯草芽孢桿菌BacillussubtilisLiu-3菌體，製備步驟為：1）用接菌環取生長在固體培養基上的BacillussubtilisLiu-3菌1環，接入5mL的液體培養基中，35-37℃，300-400r/min，搖床培養20-24h；2）將得到的一級種子培養液5mL，接入1000mL液體培養基中，35-37℃，300-400r/min，搖床培養20-24h；3）將得到的二級種子培養液1000mL，接入30L液體培養基中，35-37℃，200r/min，發酵培養70-72h，發酵液為每mL含有2億個菌以上。本發明用於大田作物、果樹與各種蔬菜瓜果的栽培等；本發明可以促進植物生長和提高作物的產量，具有可觀的經濟效益和社會效益。
【專利說明】一種水溶生物肥料
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種水溶生物肥料。
【背景技術】
[0002]隨著中國農業的集約化、規模化發展，以及水資源的日漸匱乏，滴灌、噴灌節水設施農業面積迅速擴大，水溶性肥料是水肥一體化肥料，也是中國肥料工業和產業未來發展的重點。
[0003]當前，農業生產中使用的水溶性肥料大多數是化學肥料，廣施化肥不僅造成了土壤汙染，還加重了水體的富營養化汙染，甚至影響到地下水和空氣。超高量施用化肥也破壞耕地的土壤結構。降低農產品的品質，病蟲害發生率提高。同時，化肥生產的超常發展，加速了礦質資源的耗竭。日漸成為威脅農業生產可持續發展的一大問題。我國是世界上使用化肥、農藥數量最多的國家。在我國新農村建設和發展中正確引導農民合理調整施肥結構、研製推廣肥效明顯無汙染的新型肥料，以實現農業生產增產增收、改善農產品品質、恢復和提高土壤可持續生產能力，是當前農業生產發展方向。
[0004]一種發展綠色生態農業的方法是使用生物肥料。通過增加土壤有益微生物的數量來提升土壤肥力。本發明的細菌Cfeci77w5.sub t i I i s')，特秘是Bac i I Ius subtil is Liu-3菌在生長代謝的過程中，產生生長素，植酸酶，磷酸酶等生物活性物質，促進植物根系大量地吸收土壤中的有效磷，促進植物的生長，提高植物乾重，增加植物的葉綠素含量，提升綠葉蔬菜的品相。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供了一種水溶生物肥料，用於大田作物，如玉米、小麥、大豆、甘蔗等；用於果樹，如桃樹、梨樹、棗樹、蘋果樹等；用於農業上各種蔬菜瓜果的栽培，如黃瓜、西紅柿、小白菜、豆角、茄子、生菜、油麥菜、茼蒿、絲瓜、辣椒、油菜、甜瓜、草莓、葡萄等；本發明可以促進植物生長和提高作物的產量，具有可觀的經濟效益和社會效益。
[0006]本發明提供的水溶生物肥料是以枯草芽孢桿菌(feci77w5.subtil is Liu_3,菌種保藏編號:CGMCC N0.8026。菌種保藏日:2013-08_15，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼是100101)為生物源製備的水溶生物肥料。
[0007]Bacillus subtil is Liu_3 的特徵為:
枯草芽孢桿菌，生物學命名Bacillus subtil is,細胞杆狀，大小為0.3^0.7 X
2.0^3.0 Mm,革蘭氏染色陽性，為生芽孢需氧菌，其芽孢的生物學特性為抗熱耐乾燥，芽孢為橢圓或長桶形，大小為0.2、.6 X 1.(Tl.5 μ?,位於細胞的中央或近中央。菌落為白，談黃至黃色。菌落不透明。生長溫度為22飛5°C，最適溫度37°C，最適pH 7.2。在一定的條件下菌體細胞內產生芽孢，可以耐受高溫、乾燥的不良環境條件。正常情況下可以產生生長素和植酸酶等生物活性物質。[0008]水溶生物肥料的製備步驟為:
V)取Baci I Ius subtil is Liu-3菌的液體培養基:酵母膏5g/L,蛋白腖10g/L,氯化鈉3g/L，加水至 lL，pH 為 7.2-7.4。121°C，滅菌 30min。
[0009]用接菌環取生長在固體培養基(固體培養基:酵母膏5g/L，蛋白腖10g/L，氯化鈉3g/L，瓊脂 20 g/L，加水至 1L，pH 為 7.2-7.4。121°C，滅菌 30min。)上的 bacillus Liu-3菌I環，接入5mL上述液體培養基(酵母膏5g/L，蛋白腖10g/L，氯化鈉3g/L，加水至1L，pH為 7.2-7.4。121°C，滅菌 30min。) 35_37°C，300_400r/min，搖床培養 20_24h。將此培養液稱為一級種子培養液。
[0010]2)將上述一級種子培養液5mL，接入1000 mL上述液體培養基(酵母膏5g/L，蛋白腖 10g/L，氯化鈉 3g/L，加水至 1L，pH 為 7.2-7.4。121 °C，滅菌 30min。)中，35-37。。，300-400r/min，搖床培養20_24h。將此培養液稱為二級種子培養液。
[0011]3)將上述二級種子培養液1000 mL，接入30L液體培養基(酵母膏5g/L，蛋白腖10g/L，氯化鈉 3g/L，加水至 1L, pH 為 7.2-7.4。121。。，滅菌 30min。)中，35-37 °C，200r/min，在發酵罐內發酵培養70-72h。發酵液為每mL含有2億個菌以上，取出發酵液，灌裝，備用。
[0012]本發明提供的一種水溶生物肥料，用於大田作物，如玉米、小麥、大豆、甘蔗等；用於果樹，如桃樹、梨樹、棗樹、蘋果樹等；用於農業上各種蔬菜瓜果的栽培，如黃瓜、西紅柿、小白菜、豆角、茄子、生菜、油麥菜、茼蒿、絲瓜、辣椒、油菜、甜瓜、草莓、葡萄等；本發明可以促進植物生長和提高作物的產量，具有可觀的經濟效益和社會效益。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1生長素標準曲線。
[0014]圖2 Bacillus subtil is Liu_3菌的菌液生長素的測定結果。
[0015]圖3植酸酶的測定結果。
[0016]圖4盆栽玉米的株高測定結果。
[0017]圖5盆栽玉米的乾重測定結果。
[0018]圖6盆栽玉米土壤中生長素的測定結果。
[0019]圖7盆栽玉米土壤中有效磷的測定結果。
[0020]圖8盆栽玉米土壤中磷酸酶活性的測定結果。
[0021]圖9水溶生物肥料促進黃瓜(新夏I號)苗生長的效果(n=50，P〈0.05)。
[0022]圖10水溶生物肥料促進茼蒿葉綠素含量增加的效果。
[0023]【具體實施方式】:
下面結合實施例對本發明做進一步的說明，實施例僅為解釋性的，決不意味著它以任何方式限制本發明的範圍。
實施例
[0024]實施例1
Bacillus subtil is Liu-3 的篩選
取天津市西青區精武鎮種植玉米的耕層土壤，取土壤的方法為五點取樣法。將5個取樣點的5份土壤混合,稱取10 g混合土壤,放入250mL無菌三角瓶內，加入90mL無菌水,置於恆溫震蕩培養箱，370C，180r/min,震蕩30min，取出，得到土壤微生物混懸液。取土壤混懸液ImL加入無菌水9mL，製成10mL10_2倍的土壤微生物懸液，繼續將土壤微生物懸液稀釋成10_3、10_4、10_5、10_6倍稀釋的土壤微生物懸液，取各種濃度的土壤微生物懸液200μ?塗布於培養皿內固體培養基(固體培養基:酵母膏5 g/L，蛋白腖10 g/L，氯化鈉3 g/L，瓊脂20 g/L，加水至1L，pH為7.2-7.4。121 °C，滅菌30min。)上，每個濃度3次重複，將培養皿倒置於37°C恆溫培養箱。分別在培養ld、2d、3d時，挑取單菌落細菌。共挑取100個單菌落，用接菌環分別接種在新鮮的固體培養基(固體培養基:酵母膏5 g/L，蛋白腖10 g/L，氯化鈉3g /L，瓊脂 20 g/L，加水至 lL，pH 為 7.2-7.4。121°C，滅菌 30min。)上，37°C培養 24h。得上述單菌落固體培養物共100個，將這100個固體培養物依次編號，分別記為Bacillus Liu-1 ；Bacillus Liu-2 ； Bacillus Liu-3 ；......；Bacillus Liu-1OO0
[0025]在每一個固體培養物中，用接菌環取菌一環，轉接液體培養基(酵母膏5 g/L，蛋白腖 10 g/L，氯化鈉 3 g/L，加水至 lL，pH 為 7.2-7.4。121°C，滅菌 30min。)10mL，37°C，400r/min，搖床培養24h。培養結束以後，分別測定培養液中生長素和植酸酶的含量，從中確定出生長素和植酸酶同時高含量的培養液，按照編號找出其來源的單菌落固體培養物。實驗結果顯示Bacillus Liu-3的培養液中同時具有高含量的生長激素和植酸酶，所以篩選出編號為Bacillus Liu-3的單菌落固體培養物。用接菌環將編號為Bacillus Liu_3的單菌落固體培養物轉接在新鮮的固體培養基(固體培養基:酵母膏5 g/L，蛋白腖10 g/L，氯化鈉3 g/L，瓊脂 20 g/L，加水至 lL，pH 為 7.2-7.4。121°C，滅菌 30min。)上，37°C培養 24h，培養結束將其命名為Bacillus Liu-3菌株。保存備用。
[0026]Bacillus Liu_3 菌株的特徵
(I)革蘭氏染色檢驗
採用細菌革蘭氏染色法進行染色觀察，Bacillus Liu-3菌體著色，呈現紫色。為革蘭氏染色陽性。
[0027](2)菌體形態特徵
將Bacillus Liu-3菌接種在固體培養基(固體培養基:酵母膏5 g/L，蛋白腖10 g/L,氯化鈉 3 g/L，瓊脂 20 g/L，加水至 lL，pH 為 7.2-7.4。121°C，滅菌 30min。)上，37°C培養，菌體為杆狀。37°C培養12h，菌體能運動，鞭毛周生。37°C培養24h後產生芽孢，芽孢中生，橢圓形，孢囊不膨大，抗酸染色陰性，無伴孢晶體。
[0028](3)群體生長特徵
在固體平板培養基(固體培養基:酵母膏5 g/L，蛋白腖10 g/L，氯化鈉3 g/L，瓊脂20g/L，加水至1L，pH為7.2-7.4。121°C，滅菌30min。)上，培養初期菌落淡乳白色，膿狀，圓形，邊緣不整齊，表面乾燥有褶皺；在固體斜面培養基(固體培養基:酵母膏5 g/L，蛋白腖10 g/L，氯化鈉 3 g/L，瓊脂 20 g/L，加水至 1L，pH 為 7.2-7.4。121°C，滅菌 30min。)上劃線培養，呈直線形；在液體培養基(液體培養基:酵母膏5 g/L，蛋白腖10 g/L，氯化鈉3 g/L，加水至1L，pH為7.2-7.4。121°C，滅菌30min。)中靜止培養，表面成白色菌膜。
[0029](4)生理生化特徵
將Bacillus Liu-3菌株與枯草芽孢桿菌標準菌株1504 (中國菌種保藏管理委員會)在相同的實驗條件下進行生理生化性狀檢測。結果(見表DBacillus Liu-3菌株的生理生化特徵與枯草芽孢桿菌標準菌株1504相同,說明BAB-1菌株屬於一種枯草芽孢桿菌。
[0030]表1 Bacillus Liu_3菌株的生理生化鑑定結果
【權利要求】
1.一種水溶生物肥料，其特徵在於其活性成分為枯草芽孢桿菌SUbtiliSLiu-3菌體，製備步驟為: V)取Baci I Ius subtil is Liu_3菌的液體培養基:酵母膏5 g/L,蛋白腖10 g/L,氯化鈉 3 g/L，加水至比，？!1為7.2-7.4，1211:，滅菌301^11; 用接菌環取生長在固體培養基上的subtil is Liu_3菌I環,接入5mL上述液體培養基中，35-370C，300-400r/min,搖床培養20_24h，將此培養液稱為一級種子培養液； 所述的固體培養基:酵母膏5 g/L，蛋白腖10 g/L，氯化鈉3 g/L，瓊脂20 g/L，加水至1L, pH 為 7.2-7.4，121。。，滅菌 30min。
2.—種權利要求1所述的水溶生物肥料的方法，其特徵在於包括以下步驟: V)取Baci I Ius subtil is Liu_3菌的液體培養基:酵母膏5 g/L,蛋白腖10 g/L,氯化鈉 3 g/L，加水至比，？!1為7.2-7.4，1211:，滅菌301^11; 用接菌環取生長在固體培養基上的subtil is Liu_3菌I環,接入5mL的液體培養基中，35-370C，300-400r/min,搖床培養20_24h，將此培養液稱為一級種子培養液； 2)將上述一級種子培養液5mL，接入1000mL液體培養基中，35_37°C，300_400r/min，搖床培養20-2 4h，將此培養液稱為二級種子培養液； 3)將上述二級種子培養液1000mL，接入30L液體培養基中，35_37°C，200r/min，在發酵罐內發酵培養70-72h，發酵液為每mL含有2億個菌以上，取出發酵液，灌裝，備用； 所述的固體培養基:酵母膏5 g/L，蛋白腖10 g/L，氯化鈉3 g/L，瓊脂20 g/L，加水至11^，？!1為7.2-7.4，1211:，滅菌301^11;所述的液體培養基:酵母膏5 g/L，蛋白腖10 g/L，氯化鈉 3 g/L，加水至 11^，？!1為7.2-7.4，1211:，滅菌301^11。
3.權利要求1所述的水溶生物肥料用於大田作物:玉米、小麥、大豆、甘蔗；用於果樹:桃樹、梨樹、棗樹、蘋果樹；用於農業上各種蔬菜瓜果的栽培:黃瓜、西紅柿、小白菜、豆角、茄子、生菜、油麥菜、茼蒿、絲瓜、辣椒、油菜、甜瓜、草莓、葡萄。
【文檔編號】C05F11/08GK103833427SQ201310546803
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2013年11月7日 優先權日:2013年11月7日
【發明者】劉麗麗 申請人:天津師範大學