人口腔鱗癌cal-27-hcpt耐藥細胞株的製作方法

2023-06-17 00:52:01 1

人口腔鱗癌cal-27-hcpt耐藥細胞株的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株。該細胞株是保藏號為CCTCC NO：C2012151的人口腔鱗癌CAL-27-HCPT耐藥細胞株，所述的耐藥細胞株具有臨床上的人口腔鱗癌的生物學性狀，是研究人口腔鱗癌細胞的耐藥機制的理想模型。
CCTCC NO：C2012149
20121025

CCTCC NO：C2O12151
20121025

CCTCC NO：C2O1215O
20121025
【專利說明】人口腔鱗癌CAL-27-HCPT耐藥細胞株
[0001] 本申請是以下申請的分案申請：申請日，2013年1月17日；申請號， 201310017722. 3 ;發明創造名稱，人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株的培養方法及培養所得的 細胞株。

【技術領域】
[0002] 本發明屬於生物【技術領域】，特別涉及一種人口腔鱗癌CAL-27-HCPT耐藥細胞株。

【背景技術】
[0003] 在我國，口腔頜面部的惡性腫瘤以癌為最常見，肉瘤較少。在癌瘤中又以鱗狀細胞 癌為最多見，一般佔80%以上；其次為腺性上皮癌（如黏液表皮樣癌、腺癌、腺樣囊性癌、惡 性多形性腺瘤、腺泡細胞癌等）及未分化癌。鱗狀細胞癌常向區域淋巴結轉移，晚期可發生 遠處轉移。針對鱗狀細胞癌，雖然目前已經開發出了很多的治療藥物並且已經被有效應用 於臨床上，然而，在眾多的化療過程中經常遇到耐藥和多藥聯用耐藥的情況。耐藥性一般由 眾多因素導致，其中不容忽視的是個體化基因的差異，差異基因的篩查與深入的耐藥分子 機制研究對未來的臨床治療有很深遠的意義。傳統誘導與篩選的方法建立的口腔鱗癌細胞 株由於大劑量給藥對細胞狀態影響較大，造成差異基因的人為改變，不利於後期篩查。


【發明內容】

[0004] 本發明所要解決的技術問題是為了克服目前常規方法篩選得到的人口腔鱗癌耐 藥細胞株容易因人為因素造成基因改變的缺陷，而利用人口腔鱗癌CAL-27細胞作為親本 細胞，選用臨床常用腫瘤化療藥物作為篩選藥物，在體外模擬人體體內給藥後藥物的真實 作用過程，從而建立起一套穩定有效的耐藥細胞株篩選體系和方法。
[0005] 本發明提供的技術方案之一是：
[0006] 一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株的培養方法，其包括如下步驟：
[0007] (1)在細胞培養皿中種植人口腔鱗癌CAL-27親本細胞，細胞長至貼壁後待融合率 達到30?40%時加入篩選藥物，初始濃度採用該藥物的IC 2tl值，連續作用24?72小時後 洗去死細胞並擴增存活的細胞；
[0008] (2)待細胞重新處於對數生長期時，將細胞重複步驟（1)中所述洗去死細胞並擴 增存活的細胞的操作，並將篩選藥物的濃度提高一倍進行作用，在篩選藥物的濃度提高至 第一定值時，降低藥物濃度增加倍數，在篩選藥物的濃度加至第二定值時，將細胞經過凍存 後復甦細胞，即製得人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株；所述第一定值的判斷標準是指到該第 一定值的下一個倍增值時，觀察到細胞大量死亡，細胞狀態變差，所述第二定值的判斷標準 是細胞在該第二定值的反覆作用下能夠正常生長，到該第二定值下一個倍增值時細胞增殖 不受影響，細胞生長正常。
[0009] 本發明中，步驟（1)較佳地在細胞長至貼壁後待融合率達到35?40%時加入篩選 藥物；步驟（1)較佳地在連續作用36?48小時後洗去死細胞並擴增存活的細胞；所述的篩 選藥物為臨床上常用的腫瘤化療藥物，較佳地選自5-氟尿嘧啶（5-Fu)、順鉬（CDDP)和羥基 喜樹鹼（HCPT)中的任一種；所述的藥物的IC2tl值為臨床上常規的概念，指誘導腫瘤細胞凋 亡20 %時該藥物的濃度。
[0010] 本發明中，步驟（2)所述將細胞經過凍存後復甦細胞的操作較佳地為在細胞生長 良好，細胞對藥物耐受增加，基本不出現凋亡時，將細胞凍存3個月後復甦細胞。
[0011] 本發明中，較佳地，在步驟（1)之前還包括如下步驟：
[0012] (a)取生長狀態良好、處於對數生長期的人口腔鱗癌CAL-27細胞，用胰酶消化計 數；
[0013] (b)在細胞培養容器中種植8組細胞，每組3個重複樣品，每個樣品加入細胞數為 8000個，待細胞生長至貼壁；
[0014] (c)在含10% FBS的高糖DMEM完全培養基中添加步驟（1)所述篩選藥物形成濃 度梯度，並加入對應組別的樣品細胞中，使該篩選藥物對細胞發揮作用，待藥物作用48小 時後，加入階1'孵育4小時，然後加入三聯溶解液（10%303,5%異丁醇，0.01111 〇1/1!1(：1)溶 解，取樣於〇D595nm檢測讀值，計算IC5tl濃度，並根據IC 5tl濃度的值計算該篩選藥物的ICm 濃度。
[0015] 本發明中，步驟（a)所述用胰酶消化計數的操作中，所取的CAL-27細胞的數量與 所用的胰酶數量之間的比例為本領域常規，只要胰酶能將待消化的細胞全部覆蓋浸潤即 可；優選地，所取的CAL-27細胞的數量與所用的胰酶數量之間的比例為：每3 X IO6個細胞 用Iml lOmol/ml的胰酶消化。
[0016] 本發明中，步驟（b)所述的細胞培養容器為本領域常規，優選96孔板。
[0017] 本發明中，優選地，步驟（c)所述的篩選藥物為5-氟尿嘧啶（5-Fu)、順鉬（CDDP) 和羥基喜樹鹼（HCPT)中的任一種。
[0018] 本發明中，優選地，步驟（c)所述的濃度梯度包括如下濃度：0 μ g/ml、0. 02 μ g/ ml、0. 04 μ g/ml、0. 08 μ g/ml、0. 16 μ g/ml、0. 32 μ g/ml、0. 64 μ g/ml、I. 28 μ g/ml。
[0019] 本發明中，優選地，步驟（c)所述的計算IC5tl濃度的方法採用《定量藥理學》（孫瑞 元著，人民衛生出版社出版，1987)中所述的改良寇氏法，所述的改良寇氏法如表1所示：
[0020] 表 1
[0021]

【權利要求】
1. 一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株，其特徵在於，其是保藏號為CCTCC NO: C2012151的人口腔鱗癌CAL-27-HCPT耐藥細胞株。
2. 如權利要求1所述的人口腔鱗癌CAL-27-HCPT耐藥細胞株在製備用於哺乳動物中產 生鱗狀細胞癌的試劑中的用途。
【文檔編號】A01K67/027GK104371976SQ201410640783
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年1月17日 優先權日:2013年1月17日
【發明者】王海峰, 洪誼, 姚遠頲, 談竹君, 勞昕元 申請人:勞昕元