高性能代謝細菌的製作方法

2023-06-06 03:32:51 2

專利名稱：高性能代謝細菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的細菌及其應用。更具體來說，本發明涉及分離的抗脅迫細菌，特別是奇異球菌屬(Deinococcus)細菌，其具有在各種培養條件中生產有機酸或醇類的有利性質。本發明還涉及使用所述細菌、從特別是生物質生產有機酸或醇類的方法。發明簡介在文獻中已經報導了具有在被脅迫破壞時重新裝配其基因組的能力的細菌，例如奇異球菌屬(Deinococcus)細菌。奇異球菌是在1956年由Anderson及其合作者分離到的革蘭氏陽性細菌。這種嗜極生物對由UV和電離輻射或由交聯劑(絲裂黴素C)所引起的 DNA損傷具有抗性，並對乾旱具有耐受性。W001/0235^5顯示了奇異球菌對輻射的罕見抗性，並進一步提出了對它們進行工程改造並用於生物修復。目前尚未公開的專利申請PCT/EP2008/065613顯示了奇異球菌屬細菌能夠抵抗溶劑並轉化生物質以產生乙醇。在目前尚未公開的專利申請EP09 305041. 7中披露了其他抗脅迫細菌，以及它們的分離和/或篩選方法及其生產代謝物例如抗生素的能力。本發明源自於分離到並表徵了具有生產有機酸或醇類的顯著性質的新的抗脅迫細菌。更具體來說，本發明公開了能夠利用各種碳源生產工業上非常重要的有機酸或醇類的新的抗脅迫細菌的分離。本發明公開的這些菌株已由本發明人分離，並能利用極為廣泛的碳源，和/或具有出人意料的生產有機酸或醇類、特別是乙醇的能力。本發明涉及這些分離的細菌及其應用，特別是用於生產有機酸或醇類。發明概述本發明的第一個目的涉及分離的抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌能夠利用纖維素作為碳源在好氧條件下生產有機酸或醇。在優選實施方案中，細菌是嗜熱菌(即可以在45°C或更高溫度下是活的)，並可以在5至9的pH下是活的。本發明的另一個目的是分離的抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌是嗜熱菌，可以在5至9的pH下是活的，並產生至少2g/L乳酸。本發明的另一個目的是分離的抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌是嗜熱菌，在5至9的PH下是活的，並產生至少0. 05g/L琥珀酸。本發明的另一個目的是分離的抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌是嗜熱菌，在5至9的PH下是活的，並產生至少0. 25g/L乙酸。本發明的最優選細菌產生至少0. 004%、最優選至少0. 04%乙醇。本發明還涉及分離的抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌當在好氧條件下並在碳源存在下、更優選為存在纖維素作為碳源下培養時，生產超過0. 04%的乙醇。另一方面，本發明涉及如上定義的分離的抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其能夠進一步利用其他底物，特別是葡萄糖、澱粉和蔗糖作為碳源。本發明的優選細菌還能夠利用羧甲基纖維素、纖維二糖、半纖維素和木糖作為碳
3源。本發明事實上公開了具有利用非常大範圍的底物作為碳源的顯著能力的抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌的分離。本發明的具體細菌是奇異球菌屬細菌，其可以選自例如耐放射奇異球菌(D.radiodurans)、熱泉奇異球菌(D. geothermalis)、墨氏奇異球菌(D murrayi)、解纖維奇異球菌(D. cellulosilyticus)或沙漠奇異球菌(D. deserti)菌株。這樣的細菌的具體實例包括選自2009年5月7日保藏在CNCM(巴黎巴斯德研究所國家微生物培養物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes-Institut Pasteur-Paris))的保藏號為CNCM 1-4155的奇異球菌屬菌株M11_9D、2009年5月7日保藏在CNCM的保藏號為CNCM 1-4156的奇異球菌屬菌株MC2-2A和2009年5月7日保藏在 CNCM的保藏號為CNCM 1-4157的奇異球菌屬菌株M13-1A，或所述細菌的衍生株、突變株、轉化體或後代。本發明的另一個目的是生產有機酸或醇、特別是乙醇的方法，所述方法包含將如上公開的細菌在適合碳源存在下進行培養，以及收集有機酸或醇。本發明的另一個目標是將如上定義的細菌用於生產生物醇、優選乙醇。本發明還涉及包含如上公開的細菌的培養裝置或發酵罐。發明詳述本發明涉及抗脅迫細菌及其在有機酸或醇類生產中的應用。在本發明的文本中，術語「抗脅迫細菌」更具體來說是指當受到脅迫破壞時具有完全或部分重新裝配其基因組的能力的細菌。脅迫可以是任何細胞破壞性DNA損傷性處理， 例如足以在大腸埃希式桿菌(E.coli)細菌培養物中引起90%以上細胞死亡的處理。更優選情況下，細胞破壞性DNA損傷性處理是足以使大腸埃希式桿菌培養物中細菌滴度的對數減少至少2的處理。這樣的處理的實例包括輻射，優選為重複和連續的UV輻射，和/或使用基因毒物。優選的脅迫處理是0. 5至400mJ/cm2之間、更優選為1至200mJ/cm2之間、典型為1至100mJ/cm2之間的UV輻射，其施加約5」至5』的時間長度。優選的UV處理是4mJ/ cm2處理30秒，其可以以1至8小時之間、優選3至5小時、更優選約4小時的時間間隔重複。本發明的具體細胞脅迫處理已描述在未公開的專利申請EP09 305041. 7中，其在此引為參考。更具體來說，本發明的抗細胞脅迫細菌包括奇異球菌屬(Deinococcus)細菌、硫單胞菌屬(I^pidimonas)細菌、特呂珀菌屬(Tru印era)細菌、產卟啉桿菌屬 (Porphyrabacter)細菌、新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)細菌或微小桿菌屬 (Exiguobacterium)細菌。本發明的優選細菌是奇異球菌屬細菌、特別是嗜極奇異球菌屬細菌，更優選為選自耐放射奇異球菌(D. radiodurans)、熱泉奇異球菌(D. geothermalis)、 墨氏奇異球菌(D murrayi)、解纖維奇異球菌(D. cellulosilyticus)或沙漠奇異球菌 (D. deserti)的奇異球菌屬細菌。已經顯示，奇異球菌屬細菌具有當受到脅迫破壞時完全或部分重新裝配其基因組的能力。正如前面提到的，已經提出將這些細菌、特別是耐放射奇異球菌用於生物修復。在目前尚未公開的PCT/EP2008/065613中，披露了奇異球菌屬細菌從生物質生產生物能產品的能力。現在，本發明源自於分離到並表徵了具有高抗脅迫性能的細菌。更具體來說，本發明提供了分離的抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其已由本發明人分離，具有提高的生產有機酸或醇類的性能，特別是在碳源利用和/或生產水平方面。在本發明的文本中，術語有機酸更具體是指選自甲酸、乙酸、乳酸、丁酸、葡萄糖酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸、延胡索酸、蘋果酸、丙酮酸、衣康酸和曲酸的有機酸。更優選情況下，本發明的分離的細菌產生至少一種、更優選至少兩種上述有機酸。本發明的最優選的細菌生產丙酮酸、乳酸、琥珀酸、乙酸、甲酸和/或蘋果酸。就此而言，本發明的優選細菌是抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其產生至少 0. lg/L乳酸，更優選至少0. 5g/L、更優選0. 8g/L、最優選至少2g/L乳酸。本發明的另一種優選細菌是抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其產生至少 0. 05g/L琥珀酸。本發明的另一種優選細菌是抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其產生至少 0. 25g/L 乙酸。本發明的另一種優選細菌是抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其生產甲酸或蘋果酸。在本發明的文本中，術語醇類更優選是指乙醇、丁醇、丙醇、甲醇、異丙醇、丙二醇、 甘油或2，3_丙二醇，優選為乙醇。就此而言，本發明的優選細菌是抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其產生至少 0. 004%、更優選至少0. 015%、最優選至少0. 04%乙醇。乙醇的％是指每克培養基的乙醇克數(即典型情況下，乙醇=Ig乙醇/IOOg培養基=IOg乙醇/L)。正如在實驗部分中公開的，現在已分離到具有這樣的性質的抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其在各種工業領域中特別有用。更有趣的是，細菌除了上述生產能力之夕卜，還表現出下列一種或多種性質-它是嗜端微生物，-它在4至9之間的pH下是活的，-在2%乙醇存在下是活的，-它可以在好氧或厭氧條件下生長，和/或-它能夠利用纖維素或其衍生物作為碳源。該最後一種性質是特別有利和出人意料的。事實上，使用纖維素(或其衍生物) 作為唯一碳源需要包含至少一種纖維二糖酶和一種葡聚糖酶的有效酶系統，並顯示了本發明的細菌在多樣化工業條件下生長的能力。纖維素衍生物的實例包括例如微晶體纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基甲基纖維素、粉末纖維素和纖維素填料。這些纖維素或衍生物的商業來源包括例如Whatman紙、Avicelle (微晶體纖維素)或Solka Floc (粉末纖維素)。本發明的細菌使用纖維素的能力，例如由它們在Whatman紙上生長的出人意料的能力來說明。這種紙包含纖維素或其衍生物，並且它作為碳源的使用和完全降解需要包含外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶和纖維二糖酶的有效的酶複合物。結果，本發明的具有利用纖維素或Whatman紙作為碳源的能力的細菌，預計將能夠在非常大量的各種物質、包括生物質上非常有效地生長和/或轉化它們。就此而言，驚人地注意到，在200株測試的奇異球菌屬新分離株中，有5株顯示出完全降解Whatman紙的能力。
因此，本發明的菌株不僅顯示出用於生產代謝物的顯著性質，而且它們生長在或者能夠利用特定物質作為碳源，這使得它們對於工業應用來說特別有利。本發明的目的涉及分離的抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌能夠利用纖維素作為碳源在好氧條件下生產有機酸或醇。本發明的優選細菌包括含有至少一種纖維二糖酶和葡聚糖酶的有效酶系統，並能優選完全地降解纖維素(例如Whatman紙)。此外，本發明的優選細菌還能利用其它底物作為碳源，特別是葡萄糖、澱粉和蔗糖。本發明的優選細菌也能利用羧甲基纖維素、纖維二糖、半纖維素和木糖作為碳源。本發明的另一個目的是分離的抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌是嗜熱菌，在5至9之間的pH下是活的，並產生至少2g/L乳酸。本發明的另一個目的是分離的抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌是嗜熱菌，在5至9之間的pH下是活的，並產生至少0. 05g/L琥珀酸。本發明的另一個目的是分離的抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌是嗜熱菌，在5至9之間的pH下是活的，並產生至少0. 25g/L乙酸。本發明的另一個目的是分離的抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌是嗜熱菌，在5至9之間的pH下是活的，並產生至少0. 004%乙醇、優選至少0. 04%乙醇。正如上面討論的，有利情況下，本發明的優選細菌利用纖維素作為碳源。此外，它們可以利用其它物質例如葡萄糖、澱粉和蔗糖、羧甲基纖維素、纖維二糖、半纖維素和木糖。細菌可以培養和/或維持在任何適合的培養基和裝置中。這些培養基的實例包括在實施例中公開的葡萄糖複合培養基或成分限定培養基。適合的培養基也可商購。本發明的細菌的具體實例是2009年5月7日保藏在CNCM的保藏號為CNCM 1-4155 的奇異球菌屬菌株M11-9D、2009年5月7日保藏在CNCM的保藏號為CNCM 1-4156的奇異球菌屬菌株MC2-2A和2009年5月7日保藏在CNCM的保藏號為CNCM 1-4157的奇異球菌屬菌株M13-1A，或所述細菌的衍生株、突變株、轉化體或後代。正如在實施例中公開的，這些保藏菌株都是嗜熱菌，能夠在5至9之間的pH下生長，和/或能夠利用纖維素(正如使用Whatman紙所說明的)作為碳源。MC2-2A具有利用廣範圍底物例如CMC、纖維二糖、木聚糖或木糖以及生產有價值有機酸的顯著能力。M13-1A具有當在存在Whatman紙作為唯一碳源的條件下培養時生產顯著水平的乙醇的出人意料的能力。M119-D具有生產2. 5g/L以上乳酸的顯著能力，這對於奇異球菌屬細菌來說是沒有先例的。因此，本發明的這些細菌顯示出在底物利用和/或代謝物生產方面的顯著性質的組合，其對於工業目的來說特別有用。應該理解，使用本發明的教導和例如下面在實驗部分中描述的實驗程序，可以篩選或分離到具有本發明的性質的其他抗脅迫細菌，例如奇異球菌屬細菌。具體來說，既然本發明人已經證實了某些抗脅迫細菌在Whatman紙上生長的能力，專業技術人員按照實驗部分中提供的流程，能夠分離到具有這樣的性質的其他菌株。就此而言，本發明的其他目的是分離抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬細菌的方法， 所述方法包含
-提供可能含有細菌的樣品；-對所述樣品進行DNA斷裂處理，-將所述樣品在存在纖維素或其衍生物(例如Whatman紙)的條件下進行培養，以及-從所述培養分離生長或活的細菌。按照這種方法，本發明人分離到組合了上述優越特點的其他菌株。具體來說，分離到能夠在5至9之間的pH下生長，並能生產超過0. 3g/L乳酸的嗜熱奇異球菌屬菌株，顯示了上述方法的用途。按照上述方法，本發明人還能分離到能夠在5至9之間的pH下生長，並能在使用纖維素的培養中生產乙醇的其他嗜熱奇異球菌屬菌株。這樣的細菌的實例包括-奇異球菌Mil12B，其在存在纖維素作為碳源的條件下生產0. 041%乙醇；-奇異球菌M146C，其在存在纖維素作為碳源的條件下生產0. 021 %乙醇；以及-奇異球菌M138D，其在存在纖維素作為碳源的條件下生產0.016%乙醇。因此，本發明公開了具有使用纖維素作為碳源的能力的幾種奇異球菌屬細菌。本發明公開了在脅迫培養條件下，這些細菌能夠使用纖維素生產乙醇。本發明的另一個目的是如上定義的細菌的提取物。「細菌的提取物」是指從細菌獲得的任何級份，例如細胞上清液、細胞碎片、細胞壁、DNA提取物、酶或酶製備物，或通過化學、物理和/或酶處理從細菌產生的任何製備物，其基本上不含活細菌。本發明還涉及如上所述的細菌的衍生株、轉化體、突變株或後代。術語轉化體是指含有重組核酸(即在所述細菌中不是天然存在的或已被改變或複製的核酸)的菌株。術語突變株是指從誘變處理產生的菌株。衍生株是指從本發明的菌株通過例如篩選獲得的任何菌株，其保留了利用所述碳源和生產有機酸或醇的能力。本發明的另一個目的涉及如上定義的細菌生產有機酸或醇的應用。本發明的另一個目的涉及如上定義的細菌生產生物醇類、優選乙醇的應用。本發明還涉及生產醇類、優選乙醇的方法，所述方法包含將如上定義的細菌在合適底物的存在下進行培養，並收集醇。底物可以是任何培養基或各種類型的生物質或從其衍生的產物。具體來說，所述酸和醇類可以從可再生資源、特別是植物或動物生物質或從市政和工業廢物生產。在本發明的文本中，術語「生物質」是指能夠用於工業生產的活的或死的生物材料。更通常情況下， 生物質是指例如植物物質、動物物質、可生物降解廢物。生物質可以源自於大量植物類型， 包括芒屬、柳枝黍、大麻、甜菜、小麥、玉米、白楊、柳樹、高粱、甘蔗和從桉樹到油棕的多種樹種。本發明的生物質可以包含原生物質和/或二次生物質。原生物質是來自於生物物質的未加工的材料。其實例包括林業產品例如不適合用於木材或紙生產的成熟樹木、農產品例如禾本科植物、作物和動物糞尿，以及水產品例如藻類和海草。二次生物質是最初源自於原生物質，已經歷顯著的化學和物理變化的任何材料。實例包括紙、皮革、棉、麻、天然橡膠製品、食品加工副產物和用過的烹調油。本發明的具體目的涉及生產生物醇的方法，所述方法包含將生物質暴露於本發明的細菌或其提取物，以及任選地收集生物醇。生物醇類優選為乙醇。
本發明的方法可以在轉化反應器中進行。「反應器」是指常規發酵罐或為執行本發明特別設計的用於生物質轉化的任何裝置或系統，因此具體來說包括生物反應器、生物過濾器、生物轉盤和其他氣相和/或液相生物反應器，特別是適用於處理生物質或生物質衍生物的反應器。可用於本發明的裝置可以連續或以分批裝料方式使用。在反應器中，為了執行本發明的方法，使用了至少一種本發明的細菌或其細菌提取物，同時對所述反應器進行布置和供料，以便在其中建立並維持物理化學條件，使得所述細菌對於所考慮的應用來說可以實施的，並任選允許並優選促進細菌在其中生長。取決於底物和細菌，方法可以在好氧、厭氧或微好氧條件下進行。本發明的其他方面和優點將在下面的實施例中公開，所述實施例應該被當作說明性的，並且不限制本申請的範圍。
實施例抗脅迫細菌已經從環境樣品中分離。具有利用特殊碳源和生產目標代謝物的出人意料的能力的細菌，已經被鑑定和表徵。這些菌株的實例已保藏在CNCM。在該實驗部分中公開了這些細菌的篩選流程和主要性質。實施例1、適於牛長的DH範圍材料和方法本方法能夠評估微生物在一定範圍的PH下生長的能力。試驗在45°C下進行(嗜熱菌株)。將在葡萄糖複合培養基中製備的預培養物(處於靜止期)離心，然後用無菌滲透水清洗三次。使用清洗過的培養物接種200 μ L PGY培養基(接種量5% )。試驗在96孔微孔板中進行。PGY含10g/L蛋白腖、5g/L酵母膏、lg/L葡萄糖。使用pH 計用 IM HCl 或 IM NaOH 控制 pH。將pH控制的培養基過濾(0. 2 μ m)。
培養在好氧條件下進行。將微孔板置於45°C培養箱中，在攪拌下培養。在7天和14天讀數後確定有效生長結果。讀數使用裸眼進行，與陽性和陰性對照進行比較。結果分離的奇異球菌屬菌株能夠在pH在5至9之間的培養基中生長。表1 嗜熱奇異球菌屬(Deinococcus)菌株生長的pH範圍
權利要求
1.一種分離的抗脅迫細菌、特別是奇異球菌屬(Deinococcus)細菌，其中所述細菌能夠利用纖維素作為碳源在好氧條件下生產有機酸或醇。
2.權利要求1的細菌，其生產選自甲酸、乙酸、乳酸、丁酸、葡萄糖酸、檸檬酸、琥珀酸、 丙酸、延胡索酸、蘋果酸、丙酮酸、衣康酸和曲酸的有機酸。
3.權利要求1的細菌，其中所述細菌能夠利用纖維素作為碳源在好氧條件下生產超過 0. 04%的乙醇。
4.權利要求1至3任一項的細菌，其中所述細菌是嗜熱菌，並在5至9之間的pH下是活的。
5.一種分離的抗脅迫細菌，特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌是嗜熱菌，在5至9 之間的PH下是活的，並產生至少2g/L乳酸。
6.一種分離的抗脅迫細菌，特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌是嗜熱菌，在5至9 之間的PH下是活的，並產生至少0. 05g/L琥珀酸。
7.一種分離的抗脅迫細菌，特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌是嗜熱菌，在5至9 之間的PH下是活的，並產生至少0. 25g/L乙酸。
8.一種分離的抗脅迫細菌，特別是奇異球菌屬細菌，其中所述細菌是嗜熱菌，在5至9 之間的PH下是活的，並產生至少0. 04%的乙醇。
9.前述權利要求任一項的細菌，其生產甲酸或蘋果酸。
10.權利要求1的細菌，其中醇選自乙醇、丁醇、丙醇、甲醇、異丙醇、丙二醇、甘油和2， 3-丁二醇，優選乙醇。
11.前述權利要求任一項的細菌，其中所述細菌能夠利用葡萄糖、澱粉和/或蔗糖作為碳源。
12.前述權利要求任一項的細菌，其中所述細菌還能夠利用羧甲基纖維素、纖維二糖、 半纖維素和木糖作為碳源。
13.前述權利要求任一項的細菌，其在45°C或更高溫度下生長。
14.前述權利要求任一項的細菌，其選自耐放射奇異球菌(D.radiodurans)、 熱泉奇異球菌(D. geothermalis)、墨氏奇異球菌(D murrayi)、解纖維奇異球菌 (D. cellulosilyticus)或沙漠奇異球菌(D. deserti)菌株。
15.一種細菌，其選自2009年5月7日保藏在CNCM的保藏號為CNCM 1-4155的奇異球菌屬菌株M11-9D、2009年5月7日保藏在CNCM的保藏號為CNCM 1-4156的奇異球菌屬菌株MC2-2A和2009年5月7日保藏在CNCM的保藏號為CNCM 1-4157的奇異球菌屬菌株 M13-1A，或所述細菌的衍生株、突變株、轉化體或後代。
16.一種生產有機酸或醇、特別是乙醇的方法，所述方法包含將權利要求1-15任一項的細菌或其提取物在合適的碳源存在下進行培養，以及收集有機酸或醇。
17.權利要求1-15任一項的細菌在生產乙醇中的應用。
18.一種培養裝置或發酵罐，其包含權利要求1-15任一項的細菌。
全文摘要
本發明涉及新的抗脅迫細菌及其應用。更具體來說，本發明涉及分離的抗脅迫細菌，其具有在各種培養條件中生產有機酸或醇類的有利性質。本發明還涉及使用所述細菌、從特別是生物質生產有機酸或醇類的方法。
文檔編號C12P7/10GK102482637SQ201080021114
公開日2012年5月30日 申請日期2010年5月12日 優先權日2009年5月14日
發明者亞奎斯·比頓, 凱斯·伊索普 申請人:德諾芙公司, 法國國家科學研究中心, 蒙彼利埃第一大學