一種穀胱甘肽的分離純化方法
2023-06-19 06:12:46 1
一種穀胱甘肽的分離純化方法
【專利摘要】本發明屬於生物化工【技術領域】，涉及一種穀胱甘肽的分離純化方法。過程包括將酵母發酵液離心，收集酵母，加入50-90℃熱水提取5-30min，調節提取液的pH值為1.5-3.0，將提取液進行過濾或離心，收集提取液；提取液依次採用超濾法和納濾法去除大分子和小分子的雜質；納濾濃縮液採用強酸性陽離子交換樹脂吸附穀胱甘肽，然後用含有氨水的甲醇或乙醇水溶液進行洗脫，將洗脫液減壓濃縮，加入三倍體積的95％的乙醇進行沉澱，沉澱物冷凍烘乾，得到純度95％以上的穀胱甘肽產品。
【專利說明】一種穀胱甘肽的分離純化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物化工【技術領域】，涉及到穀胱甘肽這種不穩定的小分子多肽的生產，尤其是將膜分離和樹脂吸附相結合的分離純化方法。
【背景技術】
[0002]還原型穀胱甘肽(Glutath1ne，簡稱GSH)是一種由L-穀氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸脫水縮合而成的具有重要生理功能的活性三肽化合物。廣泛存在於各種生物細胞中，其主要活性部位是半胱氨酸的巰基和特殊的Y-肽鍵，是生物體中的一種重要的抗氧化劑。GSH可以清除體內自由基，有保護肝臟、解毒、抗氧化、抗衰老、增強免疫力等多種生理功能，被譽為「長壽因子和抗衰因子」。
[0003]GSH的生產方法主要有四種，分別是:萃取法、發酵法、酶法和化學合成法。微生物發酵法具有反應條件溫和、步驟簡單、成本低、轉化效率高、生產速率快等優勢，是目前GSH生產的主要方法。酵母一直是研究的首選，其中釀酒酵母最為常見，相關的文獻報導也最多。從酵母中提取GSH的方法有:熱水抽提、沸水抽提、微波處理、凍融法處理、超聲波處理、甲酸抽提、乙醇抽提、液氨抽提、鹽法抽提、乙酸乙酯浸提等。其中熱水抽提法經濟清潔，不汙染產品，也不需要分離除去添加的提取劑，易與後續的純化方法相銜接，工業化生產更容易實現。純化方法主要有銅鹽法、樹脂法(離子交換法、合成汞樹脂法、大孔吸附樹脂法)、電滲析法、反膠束萃取法、雙水相法(雙水相分配結合溫度誘導相分離法)等。銅鹽法需要通入H2S氣體，有毒，操作環境差；因為提取液中含有大量的帶電荷的雜質，單純的樹脂法，選擇性差，能同時吸附大量的雜質，後續沉澱出的產品純度低；電滲析法耗能高，選擇性也差；反膠束和雙水相萃取法離工業化生產有一定的距離，比較適合理論性研究。目前我國還沒有適合工業化生產的成熟的分離純化穀胱甘肽技術。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種工業上易於實現的穀胱甘肽分離純化方法，採用超濾膜和納濾膜法先分離去除大量的大分子和小分子雜質，既可以減輕後續樹脂分離的負荷，又可以增加產品的純度，樹脂吸附後，採用含有氨水的甲醇或乙醇水溶液進行洗脫，洗脫液濃縮時，可以同時去除氨水和有機溶劑，不會在產品中殘留，也提高了終產品的純度。
[0005]本發明技術方案所採用的生產工藝過程為:酵母發酵液一離心或過濾一熱水抽提——膜分離去除雜質——離子交換樹脂吸附分離——洗脫液濃縮——乙醇沉澱——冷凍乾燥。
[0006]具體路線是:將酵母發酵液離心，收集酵母，加入50-90°C熱水提取5_30min，調節提取液的PH值為1.5-3.0，將提取液進行過濾或離心，收集提取液；提取液依次採用超濾法和納濾法去除大分子和小分子的雜質；納濾濃縮液採用強酸性陽離子交換樹脂吸附穀胱甘肽，然後用含有氨水的甲醇或乙醇水溶液進行洗脫，將洗脫液減壓濃縮，加入三倍體積的95%的乙醇進行沉澱，沉澱物冷凍烘乾，得到純度95%以上的穀胱甘肽產品。
[0007]本發明的效果益處是:
[0008](I)熱水抽提法經濟清潔，不汙染產品，也不需要分離除去添加的提取劑，易與後續的純化方法相銜接。
[0009](2)超濾和納濾膜法可以去除大部分的大分子和小分子的雜質，減輕了後續樹脂吸附的負荷，同時增加產品的純度。
[0010](3)穀胱甘肽穩定性較差，特別是不耐熱，膜法分離在常溫下進行，可以減少穀胱甘肽的損失。
【具體實施方式】
[0011]以下結合技術方案，詳細敘述本發明的具體生產步驟:
[0012](I)將酵母發酵液離心，收集酵母，按固液比1: 40，加入50_90°C熱水提取7min，調節提取液的PH值為2.0，提取完畢，將提取液在4800r/min下離心10min，去除酵母沉澱物，收集提取液。
[0013](2)提取液先採用超濾膜法去除大分子的蛋白質、多糖等雜質，超濾膜的截留分子量為10，OOODa，操作壓力0.1Mpa，透過液再採用納濾膜過濾的方法去除大部分的小分子雜質，膜的截留分子量為270Da，操作壓力為0.5Mpa。
[0014](3)以步驟⑵的納濾濃縮液為原料，採用Amberlitel20型強酸性陽離子交換樹脂吸附穀胱甘肽，流速0.5BV/h，吸附達到穿透點後，先用蒸餾水衝洗柱子，然後用含氨水質量百分比為2%的60%的甲醇或乙醇水溶液進行洗脫，流速lBV/h。
[0015](4)將洗脫液減壓濃縮，然後加入三倍體積的95%的乙醇進行沉澱，沉澱物冷凍烘乾，得到的穀胱甘肽產品，純度達95%以上。
【權利要求】
1.一種穀胱甘肽的分離純化方法，其特徵在於提取液通過膜法分離去除大部分的雜質，減輕後續樹脂吸附的負荷並增加選擇性，通過以下步驟實現: (1)將酵母發酵液離心，收集酵母，加入50-90°C熱水提取5-30min，調節提取液的pH值為1.5-3.0，將提取液進行過濾或離心，收集提取液。 (2)提取液採用超濾法去除大分子的蛋白質、多糖等雜質，然後採用納濾膜過濾的方法去除大部分的小分子胺基酸、單糖類、無機鹽等雜質。 (3)以步驟(2)的納濾濃縮液為原料，採用強酸性陽離子交換樹脂吸附穀胱甘肽，流速.0.5-1.0BV/h，吸附達到穿透點後，先用蒸餾水衝洗柱子，然後用含氨水質量百分比為1-5%的50-80%的甲醇或乙醇水溶液進行洗脫，流速lBV/h。 (4)將洗脫液減壓濃縮，然後加入三倍體積的95%的乙醇進行沉澱，沉澱物冷凍烘乾，得到的穀胱甘肽產品，純度達95 %以上。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:在樹脂吸附之前先用膜分離的方法去除大部分的大分子和小分子雜質。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟(2)中超濾膜的截留分子量為.5，000-10, OOODa，納濾 膜的截留分子量為200_270Da。
【文檔編號】C07K1/18GK104130310SQ201410231642
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年5月23日 優先權日:2014年5月23日
【發明者】常秀蓮, 趙鎮雷, 徐菡 申請人:煙臺大學