控制植物分枝的K599-orf3基因及其應用的製作方法
2023-06-18 12:49:26 2
控制植物分枝的K599-orf3基因及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種從髮根農桿菌K599中獲得控制植物分枝的K599-orf3基因，及其在控制農作物或觀賞植物分枝中的應用。所述K599-orf3基因核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，該基因開放閱讀框全長1479bp，編碼492個胺基酸（SEQ?ID?No.2）。構建含該基因的植物轉基因表達載體，並通過轉基因技術將該基因轉入植物細胞並表達，能有效增加植物的分枝；因此，將該基因轉入農作物和園藝植物中，能分別提高其生物學產量和觀賞價值，具有很好的應用潛力。
【專利說明】控制植物分枝的K599-orf3基因及其應用
(-)【技術領域】
[0001]本發明涉及從髮根農桿菌K599中獲得控制植物分枝的K599-orf3基因及其應用。
(二)【背景技術】
[0002]植物的分枝是植物的重要的形態特徵。植物分枝與其適應環境、生存競爭能力及產量形成密切相關，也決定著植物的株型(陳彩豔，鄒軍煌，張淑英，朱立煌.獨腳金內酯能抑制植物的分枝並介導植物與縱枝真菌及寄生植物間的相互作用.中國科學C輯:生命科學，2009，39:525-533。Wang YH,Li JY.Branching in rice.Curr Opin Plant Biol,2011,14:94-99)。
(三)
【發明內容】
[0003]本發明目的是提供從髮根農桿菌K599中獲得控制植物分枝的K599_orf3基因，及其在控制農作物或觀賞植物分枝中的應用。
[0004]本發明採用的技術方案是:
[0005]控制植物分枝的K599_orf3基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。該基因開放閱讀框全長1479bp，編碼492個胺基酸(SEQ ID N0.2)。
[0006]本發明還涉及 所述的基因在控制農作物或園藝植物分枝中的應用。
[0007]具體的所述應用為:構建含有所述K599_orf3基因的表達載體，以農桿菌介導法將其導入農作物或園藝植物中，獲得分枝增加的轉基因農作物或園藝植物。
[0008]本發明的有益效果主要體現在:本發明提供了從髮根農桿菌K599中獲得控制植物分枝的K599-orf3基因，構建含該基因的植物轉基因表達載體，並通過轉基因技術將該基因轉入植物細胞並表達，能有效增加植物的分枝；因此，將該基因轉入農作物和園藝植物中，能分別提高其生物學產量和觀賞價值，具有很好的應用潛力。
(四)【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1為擴增orf3的PCR產物電泳圖。M:DS?2000marker ；1:利用引物orf3A_Pl、orf3A-P2擴增的PCR產物。
[0010]圖2為重組質粒用BamH I和Sma I酶切結果。M:DS?2000marker ;1_5:重組質粒被BamH I和Sma I酶切。
[0011]圖3為植物轉基因表達載體pRI101-AN-orf3的構建示意圖。
[0012]圖4為植物轉基因表達載體pRI101-AN-orf3酶切鑑定。M:標準DNA分子量，I:pRI101-AN，2:pMD19-orf3,3:pRI101-AN_orf3。
[0013]圖5為轉K599_orf3基因菸草植株再生過程。A:葉片切塊；B:再生芽；C:再生植株；D移栽到盆缽中成活的小苗植株；E:正常開花的植株。
[0014]圖6為利用orf3基因引物對菸草再生植株進行普通PCR擴增的結果。M:DS?2000DNA marker ；1:質粒 pRI101-AN_orf3 ；2:非轉基因菸草；3_17:orf3 基因菸草再生植株。
[0015]圖7為RT-PCR鑑定結果，其中A為actin擴增出的條帶約為600bp，B為orf3基因擴增出的條帶約為1479bp。M:DS?2000marker ；1:非轉基因菸草；2_6:轉基因菸草。
[0016]圖8為轉K599_orf8基因菸草和非轉基因菸草的比較。左側:非轉基因；右側:轉基因。
[0017]圖9為轉K599_orf3基因擬南芥的篩選過程。A:擬南芥幼苗的純性培養；B:擬南芥轉基因種子萌發幼苗的篩選(絕大多數幼苗被抗生素殺死，子葉變黃髮白；部分轉基因幼苗的子葉保持綠色，繼續生長);C:擬南芥轉化陽性植株的後代在抗生素培養基上的篩選，幼苗出現遺傳分離比(綠苗:黃白苗=3:1)。
[0018]圖10為轉K599_orf3基因的擬南芥植株形態特徵。A:非轉基因；B:轉基因；C --左側為非轉基因，右側為轉基因。
(五)【具體實施方式】
[0019]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此:
[0020]實施例1:
[0021]一、orf3基因的克隆
[0022]1、實驗材料
[0023]黃瓜喊型髮根農桿菌K599由本實驗室保存(the National Collection of PlantPathogenic Bacteria in U K 購買獲取)。
[0024]2、髮根農桿菌K599所含質粒pRi2659的提取
[0025]利用Sangon公司質粒小量快速抽提試劑盒提取。具體步驟如下:(I)在28°C,200r/min,含有km (50mg/L)和str (50mg/L)LB液體培養基中過夜培養野生型髮根農桿菌K599。(2)取1.5-4.5ml菌液，9，000r/min離心30秒，儘可能倒幹上清液，收集菌體。(3)用250微升溶液SI重懸菌體沉澱，渦旋振蕩至徹底懸浮。(4)加250微升溶液S2，溫和地上下翻轉4-7次，使菌體充分裂解，室溫放置4分鐘。(5)加350微升溶液S3，立即溫和地上下翻轉4-7次，充分混勻時會出現白色絮狀沉澱。冰上靜置3-5分鐘，13，000r/min離心10分鐘，小心取上清。(6)將上一步所得上清加入吸附柱中(吸附住放入收集管中)，13，OOOr/min離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。(7)加入500微升去蛋白液PE, 13，000r/min離心30-60秒，棄廢液。(8)加入700微升漂洗液PW (已加入無水乙醇)，12，000r/min離心30秒，棄廢液。(9)加入500微升漂洗液PW (已加入無水乙醇)，12，000r/min離心30秒，棄廢液。(10)將吸附住放回空收集管中，13，OOOr/min離心2分鐘，儘量除去漂洗液。(11)取出吸附住，放入一個乾淨的離心管中，在吸附膜的中間部位加50微升ddH20，室溫放置2分鐘，12，000r/min離心1分鐘，即得到質粒，放於_20°C冰箱備用。
[0026]3、PCR 擴增
[0027]根據異黃瓜鹼型髮根農桿菌Ri質粒pRil724 (GenBank登陸號NC_002575)以及農杆鹼型髮根農桿菌Ri質粒pRiA4 (GenBank登陸號K03313),通過blast比較,根據保守序列設計引物。引物由上海Sangon公司合成。並且在引物上加上限制性核酸內切酶Sma I(上遊WPBamH I (下遊)的位點序列。引物序列如下:orf3A_Pl: 5』-GACCCGGGACAATGTTTGCGTGCAAGG-3』，orf3A-P2:5』 -GCGGATCCTGCTTCTGTTTTGTATCGTGCT-3』。
[0028]PCR擴增反應體系見下表1。用美國ABI公司PE9700型DNA擴增儀進行擴增。PCR反應程序如下:94°C 5min使模板充分變性，然後進入擴增循環，每次循環包括:94°C 45s保持模板變性，然後55°C 45s復性，72°C 90s延伸，完成一個循環，重複30-35次，而後72°C IOmin使DNA延伸完整，最後4°C條件下保存以備用。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳30_60min，溴化乙錠(EtBt)染色，用美國BIO-RAD凝膠成像系統觀察並拍照。
[0029]表1:PCR反應體系
【權利要求】
1.控制植物分枝的K599-orf3基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.如權利要求1所述的基因在控制農作物或園藝植物分枝中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述應用為:構建含有所述K599-orf3基因的表達載體，以農桿菌介導法將其導入農作物或園藝植物中，獲得分枝增加的轉基因農作物或園藝植物。
【文檔編號】C12N15/84GK103898129SQ201410064202
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年2月25日 優先權日:2014年2月25日
【發明者】向太和, 王沙沙, 王嫚, 宋亞玲, 錢永生, 孫揚 申請人:杭州師範大學