一種將microRNA轉染到血小板中的方法
2023-06-19 01:24:51 1
一種將microRNA轉染到血小板中的方法
【專利摘要】本發明公開了一種將microRNA轉染到血小板中的方法，包括如下步驟：a）將待轉染microRNA與脂質體制混勻，得混合溶液；b）在溫度為22℃，振蕩頻率為60Hz的條件下，將步驟a的混合溶液與血小板共培養，培養時間為12～36h，離心，收集血小板，即可。本發明方法可以有效地將microRNA轉染至血小板中，克服了現有技術的缺陷。
【專利說明】—種將microRNA轉染到血小板中的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種將microRNA轉染到血小板中的方法。
【背景技術】
[0002]血小板是體內血栓形成的關鍵成分之一，在心血管疾病(增殖、血栓形成和血栓栓塞)、炎症和部分腫瘤等多種病理生理進程中扮演重要角色。microRNAOiiiRNA)是一類由內源基因編碼的長度為20-24個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們在動植物中參與轉錄後基因表達調控。
[0003]研究表明，血小板內包含大量miRNAs，部分與體內纖溶、凝血過程相關的血小板miRNAs可能是體內血栓形成潛在的分子標誌物。
[0004]然而，由於血小板內部缺乏細胞核和基因組DNA，使得血小板內直接轉染miRNA技術異常困難，使得血小板miRNA標誌物的研究一直停滯不前，急需尋找一種能夠將miRNA直接導入血小板中的方法。
【發明內容】
[0005]為了解決上述問題，本發明提供了一種將HiiCT0RNA轉染到血小板中的方法。
[0006]本發明將microRNA轉染到血小板中的方法，包括如下步驟:`[0007]a)將待轉染microRNA與脂質體制混勻，得混合溶液；
[0008]b)在溫度為22°C，振蕩頻率為60Hz的條件下，將步驟a的混合溶液與血小板共培養，培養時間為12~36h,離心,收集血小板,即可。
[0009]microRNA (miRNA)是一類長度約為20-24個核苷酸的小RNA。
[0010]步驟a)中，所述脂質體為陽離子脂質體。優選地，所述陽離子脂質體是siPORTTMNeoFXTM 或 Lipofectamine2000。
[0011]步驟a)所述混合溶液中，microRNA的濃度為0.7~0.8mol/L，脂質體的濃度為5~7%(v/v)。優選地，所述microRNA的濃度為0.74mol/L，脂質體的濃度為5.9%(v/v)0
[0012]步驟a)中，混勻的方法如下:將脂質體和待轉染HiiCT0RNA混合，在溫度為15~250C，震蕩頻率為50~70Hz的條件下，放置10~30min，即得混合溶液。優選地，所述溫度為22°C，震蕩頻率為60Hz，放置時間為20min。
[0013]步驟b)中，所述培養時間為24h。
[0014]本發明還提供了前述任意一項所述方法製備的血小板。
[0015]發明人在前期試驗中，採用常規的脂質體轉基因方法轉染miRNA至血小板中，SP將miRNA與脂質體混合，形成混合物，再在37°C與血小板共培養，然而，經檢測發現，該種方法難以有效地將microRNA轉入血小板中。
[0016]發明人也是偶然發現，在溫度為22°C，振蕩頻率為60Hz條件下，將microRNA與脂質體混合物，與血小板共培養，可以將microRNA轉入血小板中。
[0017]另外，發明人通過篩選實驗發現，只有在溫度為22°C，振蕩頻率為60Hz條件下才能有效轉染，培養溫度和震蕩頻率有微小變動，則難以達到目的。
[0018]本發明方法可以將microRNA導入血小板中，使得血小板miRNA的功能鑑定成為可能，同時為篩選血小板的miRNA治療藥物提供了體外篩選體系，臨床應用前景良好。
[0019]顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0020]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1血小板中miR-30c含量檢測結果圖，其中，NC表示空白組，miRNA-30c表示轉染miRNA-30c後血小板的含量，Ant1-miRNA-30c表示轉染Ant1-miRNA_30c後血小板的含量。
[0022]圖2血小板內PA1-1含量檢測結果圖，其中，NC表示空白組，miRNA_30c表示轉染miRNA-30c後血小板的含量，Ant1-miRNA_30c表示轉染Ant1-miRNA_30c後血小板的含量。
【具體實施方式】
[0023]實施例1本發明在血小板內轉染microRNA的方法
[0024]取脂質體siPORTTMNeoFXTM和待轉染microRNA，分別製成溶液，混合，在溫度為15°C，震蕩頻率為50Hz的條件下，放置lOmin，得混合液，混合液中microRNA的濃度為0.7mol/L，脂質體的濃度為5% (v/v)；
[0025]在溫度為22°C，振蕩頻率`為60Hz的條件下，將前述混合液與血小板共培養，培養時間為12h，離心，收集血小板，即可。
[0026]實施例2本發明在血小板內轉染microRNA的方法
[0027]取脂質體Lipofectamine2000和待轉染microRNA,分別製成溶液，混合,在溫度為25°C，震蕩頻率為70Hz的條件下，放置30min，得混合液，混合液中microRNA的濃度為0.8mol/L，脂質體的濃度為7% (v/v)；
[0028]在溫度為22°C，振蕩頻率為60Hz的條件下，將前述混合液與血小板共培養，培養時間為36h，離心，收集血小板，即可。
[0029]實施例3本發明在血小板內轉染microRNA的方法
[0030]取脂質體Lipofectamine2000和待轉染microRNA,分別製成溶液，混合,在溫度為22°C，震蕩頻率為60Hz的條件下，放置20min，得混合液，混合液中microRNA的濃度為0.74mol/L，脂質體的濃度為5.9% (v/v)；
[0031]在溫度為22°C，振蕩頻率為60Hz的條件下，將前述混合液與血小板共培養，培養時間為36h，離心，收集血小板，即可。
[0032]以下採用實驗例的方式驗證本發明方法可以將HiiCT0RNA有效轉入血小板中:
[0033]實驗例I
[0034]血小板中存在miR-30c，其可以下調PA1-1 (纖溶酶原激活物抑制物I)的表達。若在血小板中導入miR-30c，血小板中miR-30c的含量應當增加，PA1-1表達應當下調；若在血小板中導入ant1-miR-30c (反義miR_30c),血小板中miR_30c的表達應當被抑制,PA1-1的表達應當上調。
[0035]因此，如下實驗採用本發明方法轉染miR_30c和antiniR-30c(反義miR_30c)的，通過檢測miR-30c的表達量和PA1-1的表達量，驗證轉染是否成功。
[0036]miR-30c 的序列:uguaaacauccuacacucucagc ；
[0037]ant1-miR-30c 的序列:cugggagaaggcuguuuacucu。
[0038]一、實驗材料:
[0039]健康人外周血加入加入枸櫞酸葡萄糖(85mM檸檬酸三鈉；78mM檸檬酸，IllmM葡萄糖)抗凝;乙二胺四乙酸(EDTA) ；3ml Tyrode』 s 緩衝液(containingl38mM NaCl, 5.5mMdextrose, 12mM NaHCO3, 0.8mMCaCl2, 0.4mM MgCl2, 2.9mM KCl, 0.36mM Na2HP04and20mMHepes, pH7.4) ； I μ M prostaglandin 12 ;高速冷凍離心機(Eppendorf Centrifuge5804R),自動凝膠成像系統Gel DocXR+ (美國BIO-RAD公司)，ND-1000微量紫外可見分光光度計(美國 NanoDrop 公司)，超淨工作檯(SW-CJ),超低溫冰箱(Thermo_80°C ) ,mirVanaTM miRNAIsolation Kit、siP0RTTMNeoFXTM、miR-30c、ant1-miR-30c 及其陰性 Negative Control(美國 Ambion 公司)，DEPC (美國 Invitrogen 公司)，E.coli poly (A) Polymerase、rATP (NEB公司)，逆轉錄試劑盒(TaKaRa 公司)，20bp DNA Ladder Marker>2 X Taq PCR Master Mix 等(北京天根生化科技公司)，螢光素酶檢測試劑盒(Promega)，HEK293細胞系(ATCC);酶標儀(賽默飛世爾(上海)儀器有限公司)、寡核苷酸序列、PCR引物合成和序列測序(InvitiOgen公司)；lipofectamine2000 (Invitrogen 公司)
[0040]二、實驗方法
[0041](一)、血小板準各:
[0042]採用梯度離心法，取健康志願者外周血按1:9比例加入枸櫞酸葡萄糖溶液(85mM檸檬酸三鈉；78禮檸檬酸，111禮葡萄糖)後20(^條件下離心lOmin，吸取上清富含血小板血清(PRP)。
[0043]將PRP進一步1000g離心IOmin使血小板沉澱後，加入3ml Tyrode』 s緩衝液(138mM NaCl, 5.5mM dextrose, 12mM NaHCO3, 0.8mM CaCl2, 0.4mM MgCl2, 2.9mM KC12，0.36mMNa2HPO4 和 20mM Hepes, pH7.4),再加入 I μ M 前列腺素 12 (prostaglandin 12),重懸於Tyrode』 s緩衝液中清洗3次後沉澱血小板，血小板(2X IO8個/ml)混懸於培養液DMEM中待用。
[0044](二)、血小板內轉染
[0045]miR-30c組:採用如下方法轉染miR_30c後的血小板；anti_miR-30c組(反義miR-30c):採用如下方法轉染ant1-miR-30c後的血小板；以未處理血小板作為空白對照。
[0046]轉染程序如下:
[0047]a)取血小板；
[0048]b)將siP0RTTMNeoFX?轉染試劑60 μ I，與690 μ I的DMEM培養基混勻，室溫22 V孵育5min ；
[0049]c) 245 μ I的DMEM培養基中加入15 μ I的50 μ M濃度的miR_30c使終濃度為50nM(或15 μ I的50 μ M濃度的anti_miR-30c，使終濃度50nM)，輕柔混勻後室溫22°C下放置 5min。[0050]d)將上述b和c混合，並22°C輕搖(震蕩頻率為60Hz) 20min後，按每孔500 μ I/加入6孔板待用；
[0051]e)取a步血小板懸液按每孔1500 μ I/孔覆蓋在上述混液上，前後輕輕晃動培養板以充分混勻，繼續室溫22°C振蕩培養，振蕩頻率60Hz ；
[0052]f)轉染振蕩培養24h後，離心收集血小板。
[0053](三)、檢測丨
[0054]利用莖環real-time RCR檢測轉染後miR_30c表達變化狀況；突光定量real-timeRCR檢測靶基因(PA1-1) mRNA表達變化。
[0055]小分子RNA提取方法:
[0056]首先在轉染後收集的血小板中加入2ml Lysis/Binding Buffer,並充分混勻後，加入0.2ml miRNA勻眾添加劑(Homogenate Additive),充分混勻，冰上靜置IOmin ;然後加等體積的酸-苯酹氯仿(Acid-phenol chloroform),在潤流振蕩器(Vortex)上振蕩30-60s ;室溫下10，OOOg離心5min，以分離水相和有機相，此時移取上層液體到另一離心管，並確定移取的上層液體體積。準確加入1/3體積的常溫保存的無水乙醇，並混勻後加入到濾芯(Filter Cartridge)中在10，OOOg條件下離心15s並收集濾液,此步濾芯(FilterCartridge)中可吸附mRNA。然後收集濾液,再準確加入2/3體積的常溫保存的無水乙醇，並混勻後加入到濾芯(Filter Cartridge)中在10，OOOg條件下離心15s,棄濾液,此步濾芯(Filter Cartridge)中可吸附< 200nt小分子RNA。分別取吸附mRNA的濾芯(FilterCartridge)和吸附< 200nt小分子RNA的濾芯(Filter Cartridge),加入700 μ I洗漆液(Wash solution)l後在10，OOOg條件下離心5-lOs,並棄濾液；再加入500 μ I洗漆液(Washsolution) 2/3後10，000g5-10s離心並棄濾液後，10, OOOg空轉Imin,去處殘留的洗漆液(Wash solution);將濾柱移至另一收集管(Collection Tube)中，加入100 μ 195°C預熱的洗脫液(Elution Solution)並以10，000g20-30s離心收集濾液，即為血小板mRNA。
[0057]1、血小板中miR_30c含量檢測
[0058]1. 引物的設計與合成:根據miR-30c的序列信息，設計、合成RT引物和PCR擴增引物。
[0059]反轉錄引物設計:在固定莖環結構:
[0060]GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 序列後面加上候選 miRNAs 最後6個鹼基的互補序列，形成頸環結構RT引物。
[0061]PCR引物設計:miR_30c經頸環RT逆轉錄之後，Reverse prime引物為莖環結構上固定序列，引物序列為:5』 -GTGCAGGGTCCGAGGT-3』。Forward primer(GCTGCGCTGTAAACATCCTACACT)為候選miRNAs除去莖環逆轉錄所加鹼基的剩餘序列，並在5』端增加若干GC鹼基以調適TM值。
[0062]2.miR-30c的莖環RT逆轉錄:利用上述逆轉錄引物,通過逆轉錄試劑盒(Takara)進行逆轉錄反應，獲得候選miRNAs特異性Stem-loop-cDNAs模板。
[0063]3.miR-30c的實時螢光定量PCR檢測:以人U6為內參標準，分別以miR_30c的莖環RT逆轉錄產物為模板，利用SYBR green螢光定量方法檢測miR-30c特異性表達情況。
[0064]利用BIO-RAD IQ5螢光定量PCR儀上進行實時螢光定量PCR，各樣品均設置3個平行反應。反應體系:樣品 cDNA/U6/miRNA 的標準品 2μ I, SYBR Premix Ex Taq (2Xconc)10 μ I, IOuM的引物各I μ I (Tablel)，補RNase-Free水至20 μ L.反應程序:95°C預變性2min，95°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 30s，循環 30 次，72°C延伸 3min 後，60°C到 95°C繪製融解曲線，71Cycle (每個循環降0.5°C ),2_Δ Δ Ct方法計算相對表達量。
[0065]I1、螢光實時定量PCR檢測血小板中PA1-1RNA含量
[0066]1、逆轉錄
[0067]I)在RNase free的PCR管中配置下列溶液.[0068]
【權利要求】
1.一種將microRNA轉染到血小板中的方法,其特徵在於:包括如下步驟: a)將待轉染microRNA與脂質體制混勻，得混合溶液； b)在溫度為22°C，振蕩頻率為60Hz的條件下，將步驟a的混合溶液與血小板共培養12~36h,離心，收集血小板，即可。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟a)中，所述脂質體為陽離子脂質體。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於:所述陽離子脂質體是SiPORTTMNeoFXTM或 Lipofectamine2000。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟a)所述混合溶液中，microRNA的濃度為0.7~0.8mol/L，脂質體的濃度為5~7% (v/v)。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於:所述混合溶液中，microRNA的濃度為0.74mol/L，脂質體的濃度為5.9% (v/v)。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟a)所述混勻的方法如下:將脂質體和待轉染microRNA混合，在溫度為15~25°C，震蕩頻率為50~70Hz的條件下，放置10~30min,即得混合溶液。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於:所述溫度為22°C，震蕩頻率為60Hz，放置時間為20min。`
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟b)中，所述共培養的時間是24h。
9.權利要求1~8任意一項所述方法製備的血小板。
【文檔編號】C12N5/078GK103695471SQ201310731807
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月26日 優先權日:2013年12月26日
【發明者】羅茂, 吳劍波, 李蓉 申請人:瀘州醫學院