高水平分泌表達人白細胞介素8的方法和酵母轉化子的製作方法

2023-05-26 21:06:31 2

專利名稱：高水平分泌表達人白細胞介素8的方法和酵母轉化子的製作方法
技術領域：
本發明涉及應用重組DNA技術生產基因工程蛋白藥物技術，具體來說涉及到高水平分泌 表達人白細胞介素8的方法和酵母轉化子。
背景技術：
白細胞介素8屬於CXC亞家族，單核細胞、內皮細胞等都能表達合成白細胞介素8，是一種 多源性、多功能性的細胞因子，有啟動和促進炎症反應的作用，對中性粒細胞有趨化和激活作 用，對T細胞有趨化作用，可激活嗜鹼性粒細胞，並具有促進角化細胞的分裂和趨化、刺激血 管的形成和釋放前體物質等作用。最近，人們又發現白介素8可作為許多疾病的診斷分子靶標， 如血清白介素8水平高的孕婦其後代患精神分裂症的可能性更高；尿液中白介素8濃度的高 低是判斷non-Hodgkin氏淋巴瘤的重要標記；血清水平白介素8的高低可區分子宮內膜瘤和良 性卵巢囊腫。
重組人白細胞介素8是一條單鏈、前體形式的白細胞介素8通常含有一段20個左右胺基酸 殘基組成的信號肽，成熟白細胞介素8通常是由72-80個胺基酸殘基組成的多肽，分子量在 8-10kDa之間，其在溶液中通常以二聚物的形式存在，其單體被認為是具有完全物活性。其中 一種白介素8的大腸桿菌表達產物的晶體結構巳於1991年得到了解析；不同來源的白介素8的
胺基酸序列具有較高的保守性。白介素8的趨化作用沒有種屬特異性。
隨著對白介素8作用機制及臨床應用研究的不斷深入，白介素8作為抗原和藥物篩選的 重要標記，其需求量也大大增加。目前，市場上主要利用大腸桿菌進行表達，其表達產物通 常以包涵體形式存在，要通過變性復性得複雜操作才能得到活性形式的白介素8，從來減少了活性蛋白的產率；另外，原核表達的白介素8通常以融合蛋白的形式存在，除去融合的非 白介素8片段需要經過複雜且高成本的酶切步驟才能得與天然白介素8 —級結構完全相同的 蛋白；第三，原核宿主表達尤其是在大腸桿菌中表達，可能因為LPS的存在而產生毒素性， 因此往往需要對表達純化產物的毒性進行分析測定；最後，要得到高純度的蛋白往往需要經 過多步純化操作處理，純化的步驟越多，蛋白質的得率就會越低，且更可能導致目標產物的 失活。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種人白細胞介素8在真核宿主中高水平分泌表達及快速高效 的純化方法的，根據該方法可獲得穩定、高效分泌表達人白細胞介素8的畢赤酵母轉化子並 快速高效純化到該人白細胞介素8，可保證利用該方法得到的rhIL-8具有正確的空間結構和 生物學活性。
解決上述目的的技術方案如下
(1) 複製人IL-8基因以人骨髓基質細胞提取總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總cDNA， 再以該cDNA為模板，用IL-8特異引物擴增出完整人重組IL-8基因片段，所用IL-8特異引 物中引入Xho I酶切位點和在未端引入Xba I酶切位點；回收PCR產物邊接到質粒pMD20-T 載體，得質粒rhlL-8/pMD20-T，經過測序確定為正確表達序列；
(2) 構建真垓表達載體將表達載體pPICZ a A和質粒rhIL-8/pMD20-T經過Xho I及Xba I雙酶切後純化回收，並利用T4DNA連接酶於16±1° C連接下12±1小時，得重組載體 pPICZa A-IL-8;
(3) 轉化重組載體到真核酵母宿主中重組載體pPICZa A-IL-8用Sacl單酶切線性化後， 用電擊轉化法轉入畢赤酵母X-33宿主菌中；經過Zeocin篩選得到陽性克隆，陽性克隆利用
聚合酶鏈式反應得到了驗證；
(4) 陽性克隆轉接至含有高濃度Zeocin的YPD平板，篩選到了高Zeocin抗性的轉化子， 高抗性轉化子在BMGY培養基培養至光密度值〉2. 0，離心收集細胞沉澱，用B應Y培養基重懸 細胞並使其中甲醇濃度為1.0%，誘導48小時後，經SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表達 rhIL-8酵母轉化子，搖瓶條件下，該轉化子表達的rhlL-8超過250 mg/mL;
(5) 高水平分泌表達酵母轉化子於BMGY培養基培養至光密度值〉2. 0，離心收集細胞沉澱，用BMMY培養基重懸細胞並使其中甲醇濃度為1. 0%，溫度在28±1° C繼續誘導培養72小時， 每24小時補加甲醇使其中濃度保持1. 0%，大量發酵表達rha-8，表達出的蛋白分泌在培養 基中；
(6) 誘導後的酵母轉化子上清液，利用硫酸銨沉澱和CM-陽性子交換層析兩步法，快速純 化得到線度達95%以上的重組蛋白；
(7) 酵母宿主菌中表達rhlL-8蛋白挑取含陽性克隆的畢赤酵母X-33宿主菌株，用BMGY 培養基培養至光密度值〉2. 0，離心收集細胞沉澱，用B麗Y培養基重懸細胞並使其中甲醇濃度 為1. 0%，溫度在28±1° C繼續誘導培養72小時，每24小時補加甲醇使其中濃度保持1. 0%， 大量發酵表達rhlL-8，表達出的蛋白分泌在培養基中。
所述rhIL-8特異引物為
5， -GC CTC GAG AAA AGA GAA GGT GCA GTT TTG CCA AG-3' 加入了 Xho I酶切位點 5' -GC TCT AGA TTA TGA ATT CTC AGC CCT CTT C-3' 在未端引入Xba I酶切位點。
本發明的另一目的是提供一種高水平分泌表達rhIL-8酵母轉化子。 一種高水平分泌表達rhIL-8酵母轉化子，它是由以下方法得到的-
(1) L-8基因以人骨髓基質細胞提取總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總cDNA，再以該 cDNA為模板，用IL-8特異引物擴增出完整人重組IL-8基因片段，所用IL_8特異引 物中引入Xho I酶切位點和在未端引入Xba I酶切位點；回收PCR產物邊接到質粒 pMD20-T載體，得質粒rhIL-8/PMD20-T，經過測序確定為正確表達序列；
(2) 構建真核表達載體將表達載體pPICZ a A和質粒rhIL-8/pMD20-T經過Xho I及Xba I 雙酶切後純化回收，並利用T4DNA連接酶於16° C連接下12小時，得重組載體 pPICZa A-IL-8;
(3) 轉化重組載體到真核酵母宿主中重組載體pPICZ a A-IL-8用Sacl單酶切線性化後， 用電擊轉化法轉入畢赤酵母X-33宿主菌中；經過Zeocin篩選得到陽性克隆；
(4) 陽性克隆轉接至含有高濃度800—1200 u g/mL Zeocin的YPD平板，篩選到了高Zeocin 抗性的轉化子，高抗性轉化子以BMGY培養基培養至光密度值〉2. 0，離心收集細胞沉澱， 用BMMY培養基重懸細胞並使其中甲醇濃度為1. 0%，誘導48小時後，經SDS-PAGE分 析，得到了高水平分泌表達rhIL-8酵母轉化子，搖瓶條件下，該轉化子表達的rhIL-8 超過250 mg/mL。
用本發明所述的表達方法分泌表達和純化具有生物活性的人IL-8具有顯著的優勢 一方面，它能夠防止宿主菌對表達產物的降解、減輕宿主細胞代謝的負荷以及表達產物對宿主的 毒性作用；二是能夠促進分泌蛋白按適當的方式摺疊、恢復其天然構象和活性；三是畢赤酵 母在表達重組蛋白的同時進行適度的糖基化修飾，且不會引起超抗原反應，提高使用安全性， 也有利於糖基化蛋白的生物活性；四是利用酵母載體上的分泌信號a-因子信號肽引導目的 蛋白的基因分泌表達，目的蛋白會大量分泌到培養液中，能夠形成準確的空間結構，從而保 持了 IL-8的天然活性；五是通過篩選得到了穩定且高水平分泌表達人白介素-8的酵母轉化 子；六是摸索出一條快速高效純化到了具有生物活性的人重組白介素8的方法。
本發明改變傳統的用原核大腸桿菌表達IL-8，探索出用真核宿主畢赤酵母來表達IL-8 的方法，既保證了 IL-8的生物學活性，又快速高效地獲得了大量穩定蛋白。


圖1是真核表達載體pPICZ a A-IL-8構建示意圖2篩選高水平分泌表達rhIL-8r的酵母轉化子的SDS-PAGE結果分析示意圖； 圖3是畢赤酵母表達出的rhlL-8各個時段SDS-PAGE電泳分析示意圖； 圖4不同濃度硫酸銨沉澱重組人白介素8的SDS-PAGE電泳分析示意圖； 圖5 CM-陽離子交換純化重組人白介素8的洗脫曲線圖； 圖6是陽離子交換層析方法(CM-S印harose)純化目的蛋白的結果示意圖； 圖7是小鼠中性粒細胞遷移法檢測rhlL-8生物學活性的結果示意圖。
具體實施例方式
本發明選用畢赤酵母X-33菌株，整合性表達質粒pPICZ a A。載體均購自美國Invritrogen 公司。
1、克隆rhlL-8全基因
設計一對引物，以人骨髓基質細胞取總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總cDNA，再 以該cDNA為模板，用IL-8特異引物擴增出完整人重組IL-8基因片段，PCR條件為95 °C 預變性，4tnin， 一個熱循環；95 。C熱變性30s， 55 。C褪火30s， 72 。C延伸40 s， 28個熱 循環；72 。C復性10 min。所獲得的擴增片斷接接到pMD20-T載體(購自於廣州TAKARA 公司)，用PCR，酶切和核酸測序鑑定，測定序列與Genebank公布的IL-7序列一致。 PCR擴增引物為
75， -GC CTC GAG AAA AGA GAA GGT GCA GTT TTG CCA AG_3， 加入了 Xho I酶切位點 5， -GC TCT AGA TTA TGA ATT CTC AGC CCT CTT C-3， 在未端引入Xba I酶切位點
2、 構建畢赤酵母分泌型表達載體pPICZ a A-IL-8
1) 用Xho I和Xba I雙酶切重組質粒rhIL-8/pMD20-T，獲得目的片斷rhIL-8,反就體系如 下(所用內切酶及緩衝液均購自大連TAKARA公司)
質粒rhIL-8/pMD20-T 10 XH緩衝液 Xho I Xba I 無菌水
2) 用Xho I和Xba I雙酶切pPICZa A，獲得載體片斷， 液均購自大連TAKARA公司)
質粒pPICZ a A 10XH緩衝液 Xho I Xba I 無菌水
3) 由1)及2)步後所得目的片斷和載體片斷，DNA凝膠收回試劑盒回收，該試劑盒購自大 連TAKARA公司，具體操作按試劑盒說明書進行。構建示意圖見圖l。
4) 回收得到的目的片斷和載體用T4DNA連接酶(購自大連TAKARA公司)進行連接反應，目 的基因準確插入到含有分泌信號a-因子的分泌型載體讀碼框內，反應體系如下
質粒pPICZ a A片段 1 H L
目的片段落 3pL 10X緩衝液 luL T4連接酶 0.5liL
無菌水 至10uL T4DNA連接酶於16° C連接下12小時，得重組載體pPICZ a A_IL_8。
3、 轉化重組質粒至畢赤酵母X-33中
將5-10 Pg的線性化DNA溶解在5-10叱MilliQ水中，與80叱X-33菌感受態混均，轉 至0. 2 cm冰預冷的電轉化杯中；按照Irwitrogen公司操作手冊電轉化法將重組載體轉化到
15 "
5ta
5U 5U
至50u L
反應體系如下(所用內切酶及緩衝 15 "
5ta
5U 5U
至50y L宿主菌X-33中。轉化後用含有100Pg/mL Zeocin抗生素的YPD (Yeast extract p印tone dextrose)平板進行篩選，利用PCR對轉化子進行了驗證。
4、 高水平分泌表達酵母轉化子的篩選
經PCR驗證的畢赤酵母轉化子劃線接種至含有1000 Pg/mL Zeocin抗生素的YPD平板， 篩選高抗性的轉化子，高抗性的轉化子利用BMMY小量誘導表達，高抗性轉化子以BMGY培養 基培養至光密度值〉2.0，離心收集細胞沉澱，用B醒Y培養基重懸細胞並使其中甲醇濃度為 1.0%，誘導48小時後，經SDS-PAGE分析，篩選得到了一株穩定高水平分泌表達該人重組白 介素8的酵母轉化子；SDS-PAGE篩選結果如圖2所示其中，l-4=Ze0Cin抗性水平在 lOOOyg/mL及以上的酵母轉化子，1及2被認為是高水平分泌表達的酵母轉化子；5-8為 Zeocin抗性水平在500u g/mL以下的酵母轉化子。
5、 重組表達載體pPICZ a A-IL-8在畢赤酵母X-33中的大量表達 挑取高水平分泌表達的酵母轉化子單菌落，接種至裝有50 mL YPD液體培養基的250 mL
三角瓶中，28-30 °C, 250-300 rpm，培養至菌體0D6。。=6, 0,取上述菌液，接種500mL BMGY 培養基的2， 000 mL搖瓶中，每瓶接種5 mL,於28-30 °C， 250 rpm培養至OD6。。=2-6;室溫 下1， 500-3, 000 g離心5 min，收集菌體，用1/5到1/10原培養體積的BMMY重懸菌體；溫 度在28° C繼續誘導培養72小時，每24 h向培養基中添加100%甲醇至終濃度為1. 0%;每 12小時取樣，SDS-PAGE檢測分析，SDS-PAGE電泳結果如圖3所示。
6、 rhIL-8的快速、高效純化
高水平分泌表達酵母轉化子經B應Y大量誘導表達，誘導上清液於4。C離心，收集離心後 的上清液，利用不同濃度(優選70%—90%的相對飽和度)的硫酸銨對上清液中的該rhlL-8 於4'C過夜沉澱，高速離心，收穫離心所得的沉澱(圖4)，其中，1為70%的相對飽和濃度、 2為80%的相對飽和度、3為90%的相對飽和濃度，當硫酸銨相對飽和濃度為80%時，沉澱 效果最好，且rhIL-8純度較高；所得沉澱重新溶解到含有20 mM磷酸鈉的磷酸鹽緩衝液中， 所得溶液上樣至CM-陽離子交換層析柱，用含有0. 05M NaCl的20 mM磷酸鹽緩衝液漂洗CM-陽離子交換層析柱，最後，利用O. 15MNaCl的20mM磷酸鹽緩衝液對CM-陽離子交換層析柱 進行洗脫(圖5)，洗脫液經SDS-PAGE分析表明，該方法可以得到高純度的rhIL-8 (圖6)。
培養基配方如下 1)酵母生長培養基(BMGY):
完全溶解10 g酵母提取物，20 g蛋白腖，定容到700 mL。 121 。C蒸氣高壓滅菌15-20 min，冷卻到室溫，加入IOO mL 1 M磷酸鉀溶液，100 ml YNB， 2 mL 500*B， 100 mL 10*GY;
2) 酵母誘導培養基(B隨Y)
完全溶解10 g酵母提取物，20 g蛋白腖，定容到700 mL。 121 'C蒸氣高壓滅菌15-20 min， 冷卻到室溫，加入IOO mL 1 M磷酸鉀溶液，100 mL YNB， 2 mL500*B， 100 mL10*M;
3) YPD培養基
完全溶解10 g酵母提取物，20 g蛋白腖，10 g葡萄糖，定容到1000 mL， 121 'C蒸氣高壓
滅菌15-20 min。
7、 rhlL-8蛋白的活性分析
純化所得rhIL-8蛋白活性的檢測24孔Transwell板中於每個upper wells孔加4X 105 cell/mL BALB/c小鼠中性粒細胞300 u L,於lower well中加入不同濃度的rhIL-8蛋白(0 ng， 0.25 ng, 1.25 ng, 2. 5 ng, 12.5 ng, 25 ng per mL) 300 y L，每個濃度3個平行孔。細胞 於標準條件下培養4小時後，經固定、染色和脫色後於顯微鏡下計算附於upper wells膜上 的中性粒細胞數。rhlL-8蛋白活性見圖7所示，0.25 ng/ mL蛋白就能誘導小鼠中性粒細胞 的顯著遷移，說明rhlL-8蛋白具有很高的生物學活性。序列表
〈110〉中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
〈120〉高水平分泌表達人白細胞介素8的方法和酵母轉化子
〈140〉 200910038971.4
〈160〉 2
〈170〉 Patentln version 3.1
〈210〉 1 〈211〉 34 〈212〉脆 〈213〉人工序列 1
gcctcgagaa aagagaaggt gcagttttgc caag 34
〈210〉 2 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 2
gctctagatt atgaattctc agccctcttc 30
權利要求
1、分泌表達人白細胞介素8的方法，其特徵在於主要包括以下步驟(1)L-8基因以人骨髓基質細胞提取總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總cDNA，再以該cDNA為模板，用IL-8特異引物擴增出完整人重組IL-8基因片段，所用IL-8特異引物中引入Xho I酶切位點和在未端引入Xba I酶切位點；回收PCR產物連接到質粒pMD20-T載體，得質粒rhIL-8/pMD20-T，經過測序確定為正確表達序列；(2)構建真核表達載體將表達載體pPICZ αA和質粒rhIL-8/pMD20-T經過Xho I及XbaI雙酶切後純化回收，並利用T4DNA連接酶於16±1℃連接下12±1小時，得重組載體pPICZ αA-IL-8；(3)轉化重組載體到真核酵母宿主中重組載體pPICZ αA-IL-8用SacI單酶切線性化後，用電擊轉化法轉入畢赤酵母X-33宿主菌中；經過Zeocin篩選得到陽性克隆；(4)陽性克隆轉接至含有高濃度Zeocin的YPD平板，篩選到了高Zeocin抗性的轉化子，高抗性轉化子以BMGY培養基培養至光密度值＞2.0，離心收集細胞沉澱，用BMMY培養基重懸細胞並使其中甲醇濃度為1.0％，誘導48±1小時後，經SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表達rhIL-8酵母轉化子，搖瓶條件下，該轉化子表達的rhIL-8超過250mg/mL；(5)高水平分泌表達酵母轉化子於BMGY培養基培養至光密度值＞2.0，離心收集細胞沉澱，用BMMY培養基重懸細胞並使其中甲醇濃度為1.0％，溫度在28±1℃繼續誘導培養72±1小時，每24小時補加甲醇使其中濃度保持1.0％，大量發酵表達rhIL-8，表達出的蛋白分泌在培養基中；(6)誘導後的酵母轉化子上清液，利用硫酸銨沉澱和CM-陽性子交換層析兩步法，快速純化得到線度達95％以上的重組蛋白。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述IL-8特異引物為 5， -GC CTC GAG AAA AGA GAA GGT GCA GTT TTG CCA AG-3，5' -GC TCT AGA TTA TGA ATT CTC AGC CCT CTT C-3，。
3、 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟(6)為誘導後的酵母轉化子上清 液於4。C離心，收集離心後的上清液；利用80%相對飽和濃度的硫酸銨對上清液於4°C 過夜沉澱後，高速離心，收穫離心所得的沉澱；所得沉澱重新溶解到含有20raM磷酸鈉的 磷酸鹽緩衝液中，所得溶液上樣至CM-陽離子交換層析柱，用含有0.05M NaCl的20 raM磷酸鹽緩衝液漂洗CM-陽離子交換層析柱，最後，利用O. 15M NaCl的20 mM磷酸鹽緩衝 液對CM-陽離子交換層析柱進行洗脫。
4、 一種高水平分泌表達rhlL-8的酵母轉化子，其特徵在於它是由以下方法得到的(1) L-8基因以人骨髓基質細胞提取總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總cDNA，再以該 cDNA為模板，用IL-8特異引物擴增出完整人重組IL-8基因片段，所用IL-8特異引 物中引入Xho I酶切位點和在未端引入Xba I酶切位點；回收PCR產物邊接到質粒 pMD20-T載體，得質粒rhIL-8/pMD20-T，經過測序確定為正確表達序列；(2) 構建真核表達載體將表達載體pPICZ a A和質粒rhIL-8/pMD20-T經過Xho I及Xba I 雙酶切後純化回收，並利用T4DNA連接酶於16±1° C連接下12土l小時，得重組載體 pPICZa A-IL-8;(3) 轉化重組載體到真核酵母宿主中重組載體pPICZ a A-IL-8用Sacl單酶切線性化後， 用電擊轉化法轉入畢赤酵母X-33宿主菌中；經過Zeocin篩選得到陽性克隆；(4) 陽性克隆轉接至含有高濃度800—1200 u g/mLZeocin的YPD平板，篩選到了高Zeocin 抗性的轉化子，高抗性轉化子以BMGY培養基培養至光密度值〉2. 0，離心收集細胞沉澱， 用BMMY培養基重懸細胞並使其中甲醇濃度為1. 0%，誘導48±1小時後，經SDS-PAGE 分析，得到了高水平分泌表達rhlL-8酵母轉化子，搖瓶條件下，該轉化子表達的rhlL-8 超過250 mg/mL。
5、 根據權利要求4所述的高水平分泌表達rhlL-8酵母轉化子，其特徵在於所述IL-8特異 引物為formula see original document page 3
全文摘要
本發明公開了一種高水平分泌表達人白細胞介素8的方法和酵母轉化子，主要包括以下步驟複製人IL-8基因；構建真核表達載體；轉化重組載體到真核酸母宿主中；通過篩選，得到了一株高水平分泌表達的酵母轉化子；酵母宿主中表達重組人IL-8蛋白，經硫酸銨沉澱和CM-陽離子交換層析兩步法，快速得到了純度達95％以上的重組人IL-8蛋白。本發明改變了傳統的用原核宿主大腸桿菌表達IL-8，探索出用真核宿主畢赤酵母來表達IL-8的方法，並篩選到了高水平分泌表達酵母轉化子，通過硫酸銨沉澱及CM-陽離子交換層析快速獲得取高純度的重組人IL-8蛋白，本方法既保證了IL-8的生物學活性，又快速獲得了大量穩定的蛋白。
文檔編號C12N15/81GK101575609SQ20091003897
公開日2009年11月11日 申請日期2009年4月24日 優先權日2009年4月24日
發明者吳東海, 李洪波, 許愛民, 金守光 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院