N-硝基-l-精氨酸甲酯的用途
2023-05-26 12:53:01
N-硝基-l-精氨酸甲酯的用途
【專利摘要】本發明公開了一種N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，屬於生物醫學【技術領域】。本發明以NMDA誘導皮層神經元損傷，建立興奮性神經毒性模型，結果顯示，N-硝基-L-精氨酸甲酯可通過降低NOS的活性，減少NO的生成，從而降低NO及其衍生物的毒性作用；通過升高Bcl-2mRNA及蛋白的表達，降低Bax?mRNA及蛋白的表達水平，拮抗NMDA的誘導的神經細胞凋亡，進一步說明N-硝基-L-精氨酸甲酯在NMDA誘導的神經細胞凋亡中起重要的保護作用。
【專利說明】N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，具體涉及N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備治療中樞神經系統神經元興奮毒性損傷藥物方面的應用，屬於生物醫學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]穀氨酸是哺乳類動物中樞神經系統中主要的神經遞質，NMDA受體是中樞神經系統主要的穀氨酸受體之一。NMDA介導的信號途徑在神經元生存及突觸的可塑性形成中發揮著至關重要的作用。體內外的研究顯示高濃度的穀氨酸可促使神經元損傷，穀氨酸的神經毒性通過激活細胞表面不同的穀氨酸受體，從而誘發不同的細胞內信號。在穀氨酸誘發中樞神經系統神經元興奮毒性損傷中，NMDA受體的過度激活是一個關鍵的早期步驟。NMDA受體持續性激活，可進一步激活N0S而產生N0。作為合成N0的限速酶，NOS的含量決定著N0對細胞的損傷，當大量NMDA與NMDA受體結合,可導致|丐離子的大量內流，進而激活|丐依賴的N0S，使得N0S合成的N0顯著增加，而介導興奮性毒性作用。 [0003]在神經系統中，N0在學習、記憶和調控基因表達等多種重要生理功能中發揮著重要作用，是一種重要的信使分子。過量的N0具有神經毒性，與其衍生物產生的毒性作用可導致神經細胞死亡。N0通過上調Bax，Bax的移位及對線粒體外膜通透性的改變導致細胞凋亡，N0誘導的細胞凋亡可通過Bcl-2和Bax蛋白表達的變化而發揮作用。
[0004]在多種死亡信號誘導細胞凋亡中Bcl-2家族蛋白都發揮著重要的作用。其中主要調節細胞凋亡是Bcl-2與Bax，Bcl-2是一種具有抑制細胞凋亡作用的因子，其通過中和促凋亡物質、抑制促凋亡物質的釋放等抑制神經元凋亡；而Bax可促進細胞凋亡。在凋亡調節過程中Bcl-2蛋白和Bax蛋白通過結合為二聚體而發揮作用，且二者作用相拮抗。Bcl-2蛋白表達減少或Bax蛋白表達增加時，促使細胞發生凋亡；而Bcl-2蛋白表達增加或Bax蛋白表達減少時，則抑制細胞凋亡。例如，在Αβ25_35誘導的PC12細胞凋亡中，Bcl-2mRNA及蛋白表達下降，而Bax mRNA及蛋白表達升高。而CXCL12可通過上調Bcl_2的表達，下調Bax表達而發揮對神經元凋亡的保護作用。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途。
[0006]為了實現以上目的，本發明所採用的技術方案是:
[0007]N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，具體為N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備治療中樞神經系統神經元興奮毒性損傷的藥物方面的應用。
[0008]進一步的，N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備治療由穀氨酸介導的中樞神經系統神經元興奮毒性損傷的藥物方面的應用；N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備治療由N-甲基-D-天門冬氨酸介導的中樞神經系統神經元興奮毒性損傷的藥物方面的應用。
[0009]更進一步的，N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備降低N0S活性的藥物方面的應用。
[0010]N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備提高抗凋亡蛋白Bcl-2抑制凋亡活性的藥物方面的應用；具體為N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備提高Bcl-2mRNA及蛋白表達水平的藥物方面的應用。
[0011]N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備降低促凋亡蛋白Bax促進凋亡活性的藥物方面的應用；具體為N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備降低Bax mRNA及蛋白表達水平的藥物方面的應用。
[0012]更進一步的，N-硝基-L-精氨酸甲酯為治療藥物的活性成分，其有效濃度為0.1~99.9%。所述藥物的製備方法為:取有效量的N-硝基-L-精氨酸甲酯與常規藥劑賦形劑如填充劑(糖醇類如乳糖、澱粉等)、潤滑劑(如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣等)、助流劑(如氣相二氧化娃等)、穩定劑(如抗氧化劑等)、增塑劑、崩解劑等混合製備成如片劑、膠囊劑、注射液等藥物劑型。
[0013]本發明的有益效果:
[0014]本發明以NMDA誘導皮層神經元損傷，建立興奮性神經毒性模型，結果顯示，N-硝基-L-精氨酸甲酯可以降低N0S的活性，減少N0的合成，從而減少NMDA誘導的細胞凋亡。RT-PCR結果顯示，與NMDA組相比，L-NAME組Bcl_2mRNA表達升高，Bax mRNA表達降低；Western blot檢測結果顯示，與NMDA組相比，L-NAME組Bcl_2蛋白的表達升高，Bax蛋白的表達降低(P〈0.01)。
[0015]本發明中N-硝基-L-精氨酸甲酯可通過降低NOS的活性，減少NO的生成，從而降低N0及其衍生物的毒性作用。通過升高Bcl-2mRNA及蛋白的表達，降低Bax mRNA及蛋白的表達水平，拮抗NMDA的誘導的神經細胞凋亡，進一步說明N-硝基-L-精氨酸甲酯在NMDA誘導的神經細胞凋亡中起重要的保護作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為本發明實施例1中各組細胞中N0S濃度的表達變化；
[0017]圖2為實施例1中RT-PCR檢測各組細胞Bcl_2mRNA表達變化；
[0018]圖3為實施例1中Western blot檢測各組細胞Bcl_2蛋白表達變化；
[0019]圖4為實施例1中RT-PCR檢測各組細胞Bax mRNA表達變化；
[0020]圖5為實施例1中Western blot檢測各組細胞Bax蛋白表達變化。
【具體實施方式】
[0021]下述實施例僅對本發明作進一步詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。
[0022]實施例1
[0023]N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備治療中樞神經系統神經元興奮毒性損傷藥物方面的應用。
[0024] 一、材料與方法
[0025]1、試驗動物
[0026]出生ld_3d內的健康清潔級新生SD大鼠，由新鄉醫學院實驗動物中心提供。
[0027]2、主要試劑
[0028]DMEM、胎牛血清(Hyclone)，多聚賴氨酸(美國Sigma公司)，NOS ELISA Kit (北京博奧森生物技術有限公司)，兔抗Bax、Bcl-2抗體、羊抗兔IgG II抗(武漢博士德公司),一氧化氮合酶抑制劑(N-硝基-L-精氨酸甲酯，NG-nitro-L-arginine Methyl ester, L-NAME)(碧雲天公司)，Trizol,逆轉錄及擴增試劑盒(promega公司)。
[0029]3、試驗方法
[0030](1)皮層神經元的原代培養:新生SD大鼠皮層神經元的分離、培養參照文獻進行(宋海巖等，新生大鼠大腦皮質神經元的原代培養及其鑑定)。取新生72h內的SD大鼠，75%的酒精中浸泡2min，剪刀斷頭取腦，體視顯微鏡下剝去腦膜，製備成單細胞懸液，按(1-2)X 108/L的細胞密度接種在12孔板內(預先放入多聚賴氨酸包被的蓋玻片),置於培養箱(37°C、5%C02)中培養，24h後加入終濃度為lOymol/L的阿糖胞苷以抑制非神經元的增殖，作用24h後半量換液，以後每2d半量換液，培養8d的細胞用於後續實驗。
[0031](2)試驗分組:分離培養8d的神經元隨機分為3組，每組8個孔，對照組:用DMEM常規培養；NMDA (N-甲基-D-天門冬氨酸)誘導組:培養液中加入終濃度均為100 μ m/L的NMDA誘導2h ；L-NAME組:加入L-NAME (終濃度為100 μ m/L)作用lh後，加入NMDA (其終濃度均為100 μ m/L)毒性誘導2h。
[0032](3)ELLSA檢測NOS表達:收集上述3組細胞分別加細胞蛋白裂解液裂解後收集上清，按試劑盒操作說明進行N0S濃度的檢測，用酶標儀測定A450值。
[0033](4) RT-PCR檢測各組中Bax、Bcl_2mRNA的表達:利用Trizol提取各組細胞總的RNA，分別用紫外分光光度計測定RNA濃度與純度，樣品光密度(0D )比值(0D260/0D280 )在1.8-2.0的樣品進行下一步實驗。按照試劑盒說明進行逆轉錄反應生產cDNA，進行RT-PCR 擴增，擴增條件:25μ 1 的反應體系，95°C 2min,95°C 40sec,56°C 40sec,72°C lmin,72°C 5min,30 個循環。
[0034]引物序列參見文獻(戴曉春等，轉錄因子Pax-8基因幹擾後線粒體功能對心肌細胞凋亡的影響)，由上海生工合成，如下所示:
[0035]Bcl-2 上遊引物:5』 -CTGGTGGACAACATCGCTCTG-3』(如 SEQ ID N0.1 所示)，
[0036]下遊引物:5『-GGTCTGCTGACCTCACTTGTG-3』(如 SEQ ID Ν0.2 所示)，擴增產物大小為228bp ；
[0037]Bax 上遊引物:5』 -TTCATCCAGGATCGAGCAGAG-3』(如 SEQ ID N0.3 所示)，
[0038]下遊引物:5』-TGAGGACTCCAGCCACAAAGAT-3』(如 SEQ ID N0.4 所示)，擴增產物大小為456bp ；
[0039]β -actin 上遊引物:5』 -ATCATGTTTGGGACCTTCAACA-3』(如 SEQ ID N0.5 所示)，
[0040]下遊引物:5』-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3』(如 SEQ ID N0.6 所示)，擴增產物大小為 318bp。
[0041]取擴增產物10 μ 1，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外投射分析儀觀察拍照。
[0042](5) Western blot檢測Bax、Bcl-2表達:NMDA組及L-NAME組細胞經毒性誘導2h後，細胞換液，繼續培養6h，依次收集正常組、NMDA組及L-NAME組細胞，細胞裂解勻漿後提取蛋白、定量，用10%SDS-PAGE電泳，轉膜，加兔抗Bax (1: 300)，兔抗Bcl_2 (1:500),4°C過夜，加生物素化II抗(1:500)，37°C孵育lh, TBST洗10minX3次，顯色、曝光。
[0043]4、統計分析
[0044]應用SPSS17.0統計分析軟體分析，實驗數據以x±s表示，各組數據比較採用t檢驗及單因素方差分析，P<0.05認為差異顯著，具有統計學意義。[0045]二、結果
[0046]1、各組細胞N0S水平檢測
[0047]N0S為N0生成的限速酶，作為N0S的抑制劑，L-NAME可通過抑制N0S來減少N0的生成。ELISA檢測結果顯示， 與正常組相比，L-NAME組中NOS 0D值升高，N0S的生成顯著升高(Ρ〈0.01)，而與NMDA誘導組相比，0D值降低，N0S的生成降低(Ρ〈0.01)(見圖1，*Ρ〈0.01較正常組，#Ρ<0.01較NMDA組)。
[0048]2、各組細胞中Bcl_2mRNA及蛋白的表達
[0049]Bcl-2是一種具有抑制細胞凋亡作用的因子，可通過多種方式抑制神經元凋亡。RT-PCR及Western blot檢測Bcl_2mRNA及蛋白表達結果顯示，與正常組相比，L-NAME組Bcl-2mRNA及蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義(P〈0.01);而與NMDA誘導組相比，L-NAME組Bcl-2mRNA及蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義(P〈0.01)(見圖2、3)。
[0050]3、各組細胞Bax mRNA及蛋白的表達
[0051]Bax是關鍵的促細胞凋亡因子，與凋亡密切相關，用RT-PCR及Western blot檢測BaxmRNA及蛋白的表達，結果顯示，與正常組相比，L-NAME組Bax mRNA及蛋白表達顯著增多，差異有統計學意義(P〈0.01);而與NMDA誘導組相比，L-NAME組Bax mRNA及蛋白表達明顯減少，差異有統計學意義(P〈0.01)(見圖4、5)。
[0052]三、結論
[0053]本發明以NMDA誘導皮層神經元損傷，建立興奮性神經毒性模型，結果顯示，N-硝基-L-精氨酸甲酯可以降低N0S的活性，減少N0的合成，從而減少NMDA誘導的細胞凋亡。RT-PCR結果顯示，與正常組相比，L-NAME組Bcl_2mRNA表達明顯降低，Bax mRNA表達升高，而與NMDA組相比Bcl_2mRNA表達升高，Bax mRNA表達降低；Western blot檢測結果顯示，L-NAME組與正常組相比，Bcl-2蛋白的表達明顯降低，Bax蛋白的表達明顯增高(P〈0.01)，而與NMDA組相比，Bcl-2蛋白的表達升高，Bax蛋白的表達降低(P〈0.01)。
[0054]本發明中N-硝基-L-精氨酸甲酯可通過降低N0S的活性，減少NO的生成，從而降低N0及其衍生物的毒性作用。通過升高Bcl-2mRNA及蛋白的表達，降低Bax mRNA及蛋白的表達水平，拮抗NMDA的誘導的神經細胞凋亡，進一步說明N-硝基-L-精氨酸甲酯在NMDA誘導的神經細胞凋亡中起重要的保護作用。
[0055]實施例2
[0056]N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，包括以下步驟:取有效量的N-硝基-L-精氨酸甲酯與生理鹽水混合製備注射液。
【權利要求】
1.N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特徵在於:N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備治療中樞神經系統神經元興奮毒性損傷的藥物方面的應用。
2.根據權利要求1所述的N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特徵在於:N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備治療由穀氨酸介導的中樞神經系統神經元興奮毒性損傷的藥物方面的應用。
3.根據權利要求1所述的N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特徵在於:N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備治療由N-甲基-D-天門冬氨酸介導的中樞神經系統神經元興奮毒性損傷的藥物方面的應用。
4.根據權利要求1-3任一項所述的N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特徵在於:N-硝基-L-精氨酸甲酯為藥物的活性成分，其有效濃度為0.1~99.9%。
5.根據權利要求4所述的N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特徵在於:所述藥物的製備方法為:取N-硝基-L-精氨酸甲酯與賦形劑混合即得。
6.N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特徵在於:N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備降低NOS活性的藥物方面的應用。
7.N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特徵在於:N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備提高抗凋亡蛋白Bcl-2抑制凋亡活性的藥物方面的應用。
8.根據權利要求7所述的N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特徵在於:N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備提高Bcl-2mRNA及蛋白表達水平的藥物方面的應用。
9.N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特徵在於:N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備降低促凋亡蛋白Bax促進凋亡活性的`藥物方面的應用。
10.根據權利要求9所述的N-硝基-L-精氨酸甲酯的用途，其特徵在於:N-硝基-L-精氨酸甲酯在製備降低Bax mRNA及蛋白表達水平的藥物方面的應用。
【文檔編號】A61P25/28GK103720683SQ201310692301
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月16日 優先權日:2013年12月16日
【發明者】宋海巖, 鄧曉慧, 連輝, 付潔, 高志濤, 馬傳飛 申請人:新鄉醫學院