一種重組胸腺素α1及其製備方法

2023-06-19 15:39:06 3

專利名稱：一種重組胸腺素α1及其製備方法
技術領域：
本發明涉及醫藥生物工程技術領域，是一種重組胸腺素α1及其製備方法。
Gly-Tα1的製備方法如下以人胎盤cDNA為模板進行PCR，其產物經膠回收，EcoRI/BamHI雙酶切，與pGEX-4T-1載體連接，轉化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)Ply S株，經酶切、測序、鑑定後得到工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1。該工程菌採用分批補料培養技術進行發酵，以終濃度為1mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進行誘導，誘導3～5小時，終止發酵，收穫菌體。按每克溼菌加入10ml的比例加入超聲緩衝液，冰浴中超聲破碎菌體，離心，取上清用Glutathione Sepharose 4B柱進行親和層析純化融合蛋白。將GST-Tα1融合蛋白對酶切緩衝液透析，按每單位凝血酶酶切50～500μg融合蛋白的比例加入凝血酶，25～30℃反應2～16小時。將凝血酶酶切的裂解液過GlutathioneSepharose 4B柱，收集穿過峰，對50mmol/L Tris pH8.0透析後上sourceQ陰離子交換柱，用0～1mol/LNaCl線性梯度洗脫，收集主峰。純化出的Gly-Tα1純度大於90％，表觀分子量為3.1KD。
1.試劑與材料載體質粒pGEX-4T-1 由美國耶魯大學醫學遺傳室潘星華博士贈送大腸桿菌E.coli BL21(DE3)Ply S株 購自Stratagene公司人胎盤Marathon-RoadyTM-cDNA 購自Clontech公司限制性內切酶和T4DNA連接酶 購自上海華美公司PCR引物 由上海基康生物技術公司合成膠回收試劑盒 購自上海生工生物公司2.方法(1)寡核苷酸引物的設計與合成根據GenBank中(登錄號S38640)設計出的上遊引物5′-G GG G A T C CG A C G C A G C C G T A G A C-3′下遊引物5′-G GG A A T T CT T A T T T T C T G C C T C T T C C A C-3′上遊引物內含BamHI酶切位點/G G A T C C，下遊引物內含EcoRI酶切位點/G A A T T C。5′端去掉了ATG起始密碼，3′端加上了終止密碼。
(2)PCR擴增按照Takara生物公司Pre Mix PCR Kit說明書，取5微升人胎盤cDNA為模板，取上遊引物和下遊引物各100個pmol然後進行PCR反應，第一循環為94℃1分鐘、42℃1分鐘、72℃1分鐘，然後進入94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，共35個循環，再進入72℃延伸8分鐘。
(3)重組質粒的構建將PCR擴增產物經2％的瓊脂糖凝膠電泳鑑定，膠回收，然後用Eco RI和Bam HI分別雙酶切回收的DNA片段和質粒載體pGEX-4T-1，再將兩種酶切回收片段連接，轉化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)Ply S株，通過酶切鑑定轉化子。
將上述酶切鑑定的重組載體由上海基康生物公司測序，獲得正確序列的重組質粒稱為融合表達載體pGEX-4T-1/Tα1。重組胸腺素α1的核苷酸序列見表1，與其相應的胺基酸序列見表2。
上述含重組質粒pGEX-4T-1/Tα1的大腸桿菌BL21(DE3)為工程菌，將工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可誘導表達融合蛋白。實施例2大腸桿菌工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1的發酵1.取少量大腸桿菌工程菌DE3/pGEX-4T-1/Tα1於20ml含100μg/ml氨卞青黴素的LB培養基(蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L)37℃振蕩培養過夜作為一級種子液。
2.取一級種子液，以4％接種量接種於含100μg/ml氨卞青黴素的200ml LB培養基，於三角搖瓶中37℃振蕩培養6小時，作為二級種子液。
3.按發酵罐工作體積的4％接種量將二級種子液接入含半合成培養基[(每升含胰化蛋白腖5g、酵母提取物5g、甘油10g、KH2PO42g、K2HPO44g、Na2HPO4·12H2O 7g、(NH4)2SO41.2g、NH4Cl 0.2g)]和微量元素溶液(每升含MnSO4·5H2O 0.001g、CoCl2·6H2O 0.004g、Na2MoO4·2H2O 0.002g、ZnCl20.002g、CuSO4·5H2O 0.001g、H3BO30.0005g、FeSO4·7H2O 0.02g、CaCl2·H2O 0.02g、MgSO4·7H2O 0.3g)的發酵罐中，控制溫度為37℃、空氣流速為10L/分鐘、攪拌轉速為250rpm，同時自動流加30％的氨水使pH值保持在7.0左右，培養8～12小時。
4.加入補料(每升含甘油170g、胰化蛋白腖71g、酵母提取物71g、MgSO4·7H2O 5.7g)，加快攪拌轉速至400～700rpm，增大空氣流速為12～15L/分鐘，培養4小時左右。
5.繼續補料，加入終濃度為1mmol/L的I PTG，誘導3～5小時，停止發酵，得發酵菌液。實施例3Gly-Tα1蛋白的製備與純化1.將發酵菌液離心收集菌體，用磷酸緩衝液(PBSNaCl 140mmol/L KCl2.7mmol/L Na2HPO410mmol/L KH2PO41.8mmol/L pH7.3)離心洗滌一次，再按每克溼重菌體加入10mlPBS懸浮菌體沉澱。
2.置冰浴中超聲破碎菌體，離心，取上清過Glutathione Sepharose 4B柱，棄去穿過峰，用50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L還原型穀胱甘肽(pH8.0)洗脫，收集洗脫峰，得GST-Tα1融合蛋白。
3.將GST-Tα1融合蛋白對PBS或50mmol/L Tris-HCl、2.5mmol/L CaCl2、150mmol/L NaCl(pH8.0)透析，按每單位凝血酶酶切50～500μg融合蛋白的比例加入凝血酶，25～30℃反應2～16小時，融合蛋白酶切後生成Gly-Tα1。
4.酶切裂解液過Glutathione Sepharose 4B柱，收集含Gly-Tα1的穿過峰。
5.將上述Gly-Tα1收集液對50mmol/L Tris pH8.0透析後上sourceQ陰離子交換柱，用0～1mol/LNaCl線性梯度洗脫，收集主峰，即得純Gly-Tα1。純度為90％以上，表觀分子量為3.1KD。
活性測定1.E玖瑰花結實驗按常規方法分離健康人外周血單核細胞，小牛血清調整細胞數至2×106/ml。各取200ul細胞液入試管，分別加入樣品。37℃水浴90分鐘。每支試管中加入200μl綿羊紅細胞(2×108/ml)，4℃放置2～3小時；塗片，染色，於高倍鏡下計數200個淋巴細胞中形成玖瑰花結的細胞數(結合3個及3個以上綿羊紅細胞)，計算玖瑰花形成細胞的百分數，按下述公式計算激活率。結果見表3
表3 Gly-Tα1對E-玫瑰花結形成率的影響E-玫瑰花結形成率激活率對照43.3±1.00 0Gly-Tα1(20μg/ml) 57.6±1.00**33.0％合成Tα1(20μg/ml) 60.3±2.08**39.3％n＝3，**P＜0.01，與對照相比由表3可見Gly-Tα1可顯著提高人外周血淋巴細胞E-玫瑰花結形成率，且其作用與進口的合成Tα1(日達仙)相當。
2.細胞增殖實驗取小鼠脾臟，用無菌注射器芯將脾臟擠壓過200目的鋼絲網，得到單個細胞。用含10％小牛血清的1640培養液將脾細胞配成5×106個細胞/ml，將細胞懸液以200μl/孔鋪96孔板，每孔加5μl不同濃度的Gly-Tα1及合成Tα1，復3孔，並設對照。37℃，5％CO2孵箱中培養72小時，MTT法測定。結果見表4表4 Gly-Tα1對小鼠脾細胞增殖的作用吸收值(630nm)濃度(mol/L) Gly-Tα1合成Tα1對照10-70.185±0.021**△△0.153±0.012**0.123±0.01210-80.160±0.020**0.167±0.000**10-90.177±0.019**0.178±0.016**10-100.146±0.001**0.146±0.002**10-110.121±0.0000.118±0.01510-120.122±0.0110.109±0.005n＝6，**P＜0.01，與對照相比；ΔΔP＜0.01，與合成Tα1相比由表4可見Gly-Tα1對小鼠脾細胞增殖具有顯著促進作用，其活性與進口的合成Tα1(日達仙)相當。
本發明具有以下優點1.採用基因工程方法製備重組胸腺素α1(Gly-Tα1)，克服了化學合成成本高，且汙染環境的缺點。
2.獲得的Gly-Tα1經E-玫瑰花結試驗及脾細胞增殖試驗顯示，Gly-Tα1可顯著提高人外周血淋巴細胞E-玫瑰花結形成率，對小鼠脾細胞增殖具有顯著促進作用，且Gly-Tα1的生物學活性與進口的合成Tα1(日達仙)相當。
表1Gly-Tα1基因核苷酸序列表5』-GGA TCC GAC GCA GCC GTA GAC ACC AGC TCC GAA ATC ACC ACC AAGGAC TTA AAG GAG AAG AAG GAA GTT GTG GAA GAG GCA GAA AAT-3』表2Gly-Tα1胺基酸序列表Gly Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu IleThr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu ValVal Glu Glu Ala Glu Asn
權利要求
1.一種重組胸腺素α1，其特徵在於胺基酸組成較天然胸腺素α1的胺基酸序列的N端前多一個甘氨酸。
2.權利要求1所述重組胸腺素α1的製備方法，包括(1)融合表達載體的構建；(2)大腸桿菌工程菌的發酵；(3)重組胸腺素α1的製備與純化；其特徵在於所構建的融合表達載體為pGEX-4T-1/Tα1，所用的上遊引物為5′-G G G G A T C C G A C G C A G C C G T A G A C-3′，下遊引物為5′-G G G A A T T C T T A T T T T C T G C C T C T T C C A C-3′，模板為人胎盤cDNA。
3.按權利要求2所述的重組胸腺素α1的製備方法，其特徵在於所用的大腸桿菌工程菌為DE3/pGEX-4T-1/Tα1。
4.權利要求1所述重組胸腺素α1用於製備免疫製劑藥物的用途。
全文摘要
本發明涉及醫藥生物工程技術領域，是一種重組胸腺素α1即Gly－Tα1及其製備方法。天然胸腺素α1都採用固相合成法全合成，不僅成本高，而且易汙染環境。本發明採用基因工程方法，以5′－GGGGATCCGACGCAGCCGTAGAC－3′為上遊引物、5′－GGGAATTCTTATTTTCTGCCTCTTCCAC－3′為下遊引物，以人胎盤cDNA為模板進行PCR，擴增出目的基因片段，通過EcoRI/BamHI雙酶切將目的基因定向克隆到質粒pGEX－4T－1上構建融合表達載體pGEX－4T－1/Tα1。製備的工程菌可表達出穀胱甘肽硫轉移酶－胸腺素α1融合蛋白，親和層析純化融合蛋白，凝血酶酶切釋放出Gly－Tα1，最後通過親和層析和離子交換層析純化出Gly－Tα1。經試驗，Gly－Tα1的生物學活性不亞於合成的胸腺素α1。本發明製備方法簡單，成本低廉，且不會造成環境汙染。
文檔編號A61P37/00GK1398899SQ02136180
公開日2003年2月26日 申請日期2002年7月25日 優先權日2002年7月25日
發明者郭葆玉, 苗紅, 章傑, 袁鵬群, 道書豔, 邱磊, 張冉 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學