5＇－核苷酸酶活性測定方法及5＇－核苷酸酶診斷試劑盒的製作方法
2023-06-11 16:38:36
專利名稱：5＇－核苷酸酶活性測定方法及5＇－核苷酸酶診斷試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種測定5′-核苷酸酶活性的方法，同時本發明還涉及用於實現該方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒，屬於醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
醫學研究表明，5′-核苷酸酶(5NT)增高主要見於阻塞性黃膽，也可見於肝癌和肝炎。在膽汁淤積並發膽管炎、原發性和繼發性膽汁性肝硬化和慢性肝炎時，5NT升高率高於鹼性磷酸酶；肝腫瘤和肝肉芽腫時5NT升高的敏感性高於鹼性磷酸酶。因為5′-核苷酸酶活性無生理性升高，對於診斷嬰幼兒肝病和妊娠性肝功膽汁淤積較鹼性磷酸酶不但敏感，而且有特異性。因此測定5′-核苷酸酶的活性對於疾病的診斷具有重要意義。
5′-核苷酸酶的活性測定方法很多，主要有同位素底物法、化學強酸測磷法(1925年)。據申請人了解，目前國際上普遍採用同位素底物測試法，方法為5′-核苷酸酶作用於H3-dUMP，終止反應後，通過離子交換層析柱分析結果，求得5′-核苷酸酶活性。或者利用5′-核苷酸酶作用於單磷酸腺苷後產生無機磷，再用化學強酸法分析無機磷含量得以計算出5′-核苷酸酶的活性。
同位素底物法方法複雜還有同位素汙染，而且需要同位素測定儀，因此難以切實推廣應用。無機磷測定法是1925年發明的方法，準確度不好，強酸汙染環境等等，也不適合推廣應用。
發明內容
提出一種可以克服以上現有技術缺點的5′-核苷酸酶活性的測定方法，同時給出用以實現該方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒。採用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀上進行5′-核苷酸酶活性測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發明測定5′-核苷酸酶活性的步驟如下1)、將樣品與主要由肌苷單磷酸、單磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、乙醇、過氧化氫酶、氧化型輔酶、醛脫氫酶組成的試劑混合，使之發生如下原理的反應肌苷單磷酸+水5′-核苷酸酶肌苷+單磷酸肌苷+單磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子2)、檢測最終反應物在主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
通常步驟2)將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程的測定溫度控制在常規的20℃到50℃範圍，反應時間控制在常規的2-30分鐘。
這種方法應用5′-核苷酸酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶等酶偶聯反應系統，最終將氧化型輔酶還原成還原性輔酶，因為還原性輔酶在波長340nm有吸收峰，因此測試波長340nm吸收峰的增加程度可以直接反映5′-核苷酸酶活性的大小。這個酶偶聯反應系統的優點有它利用測量氧化型輔酶被還原成還原性輔酶的生成量來反映5′-核苷酸酶活性，氧化型輔酶在溶液中的穩定性比還原性輔酶高很多，因此這個系統的穩定性很好。
這個酶偶聯反應系統組成的反應成分都是外加的，不受內、外源物質的汙染，測試結果精確。
用以實現本發明方法的5′-核苷酸酶診斷試劑盒可以是單劑，包括緩衝液 40--200mmol/l肌苷單磷酸 1--50mmol/l單磷酸鹽 0.2--10mmol/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黃嘌呤氧化酶 500--50000U/l乙醇 1--30mmol/l過氧化氫酶 500--50000U/l氧化型輔酶 0.5--20mmol/l醛脫氫酶 500--50000U/l穩定劑 10--80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利於消除內、外源肌苷及次黃嘌呤汙染試劑I緩衝液 40--200mmol/l單磷酸鹽0.2--10mmol/l核苷磷酸酶 500--50000U/l
黃嘌呤氧化酶500--50000U/l乙醇1--30mmol/l過氧化氫酶 500--50000U/l氧化型輔酶 0.5--20mmol/l醛脫氫酶500--50000U/l穩定劑 10--80％(總體積)試劑II緩衝液 40--200mmol/l肌苷單磷酸 1--50mmol/l穩定劑 10--50mmol/l雙劑的配方不僅限於上述配方，其中的試劑I的成分，乙醇、過氧化氫酶、醛脫氫酶等可以放在試劑II，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利於消除內、外源肌苷及次黃嘌呤汙染，還更有利於試劑的穩定試劑I緩衝液40--200mmol/l單磷酸鹽 0.2--10mmol/l乙醇 1--30mmol/l氧化型輔酶0.5--20mmol/l穩定劑10--50mmol/l試劑II緩衝液40--200mmol/l核苷磷酸酶500--50000U/l黃嘌呤氧化酶 500--50000U/l
過氧化氫酶 500--50000U/l醛脫氫酶 500--50000U/l穩定劑 10--80％(總體積)試劑III緩衝液 40--200mmol/l肌苷單磷酸 1--50mmol/l穩定劑 10--50mmol/l三劑的配方不僅限於上述配方，其中的試劑I的成分，單磷酸鹽、乙醇、氧化型輔酶等可以放在試劑II中，試劑II其中的成分，核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶等也可以放在試劑I中，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩衝劑的pH範圍可以是6.0-11.0。緩衝劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩衝液、磷酸鹽(Phosphate)緩衝液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩衝液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩衝液、咪唑(Imidazole)緩衝液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩衝液等，但不僅限於這些緩衝液。
以上氧化型輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+等氧化型煙醯胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩定劑10-80％或者10-50mmol/l，穩定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上。
實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關係的本發明5′-核苷酸酶診斷試劑盒較為理想緩衝液80--120mmol/l肌苷單磷酸1--5mmol/l單磷酸鹽 2--10mmol/l核苷磷酸酶5000--10000U/l黃嘌呤氧化酶 5000--10000U/l乙醇 3--12mmol/l過氧化氫酶5000--10000U/l氧化型輔酶1--5mmol/l醛脫氫酶 5000--10000U/l穩定劑10--80％(總體積)由於本發明是完全利用酶學方法，酶解反應具有特異性高的特點，不易受到內、外源其他物質的幹擾。酶法方法簡便、易於操作。酶解反應的特異性促使測試結果精確。酶解反應都是在緩衝液條件下進行，沒有汙染環境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測試成本低廉。因此可以保證具有較高的測試準確性，更便於推廣應用。
此外，本發明的顯著特色之一是可以消除內、外源肌苷及次黃嘌呤的汙染，消除內、外源肌苷及次黃嘌呤的作用發生在整個反應時間段的前半部分，在後半段時間受汙染的內、外源肌苷及次黃嘌呤已經被消耗殆盡，而在後半段時間測試5′-核苷酸酶活性所需要的肌苷及次黃嘌呤都是產生於5′-核苷酸酶的活性。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一(單劑)本實施例的5′-核苷酸酶診斷試劑盒包括
緩衝液 80mmol/l肌苷單磷酸 1mmol/l單磷酸鹽 2mmol/l核苷磷酸酶 5000U/l黃嘌呤氧化酶 5000U/l乙醇 3mmol/l過氧化氫酶 5000U/l氧化型輔酶 1mmol/l醛脫氫酶 5000U/l穩定劑 50％(總體積)在全自動生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和試劑後，使之混合，發生以下反應肌苷單磷酸+水5′-核苷酸酶肌苷+單磷酸肌苷+單磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水將最終反應物置於生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
本實施例應用5′-核苷酸酶、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶等酶偶聯反應系統，最終將氧化型輔酶還原成還原性輔酶，因為還原性輔酶在波長340nm有吸收峰，因此測試波長340nm吸收峰的增加程度可以直接反映5′-核苷酸酶活性的大小。
實施例二(雙劑)本實施例的5′-核苷酸酶診斷試劑有試劑I緩衝液 100mmol/l單磷酸鹽6mmol/l核苷磷酸酶 8000U/l黃嘌呤氧化酶8000U/l乙醇8mmol/l過氧化氫酶 8000U/l氧化型輔酶 3mmol/l醛脫氫酶8000U/l穩定劑 50％(總體積)試劑II緩衝液 100mmol/l肌苷單磷酸 3mmol/l穩定劑 30mmol/l測定5′-核苷酸酶活性時，溫度控制在30℃，反應時間15分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
具體測定步驟為肌苷單磷酸+水5′-核苷酸酶肌苷+單磷酸肌苷+單磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應物置於生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應步驟的反應時間控制在15分鐘。
實施例三(三劑)本實施例的5′-核苷酸酶診斷試劑為三劑，有試劑I緩衝液 120mmol/l單磷酸鹽 10mmol/l乙醇 12mmol/l氧化型輔酶 5mmol/l穩定劑 50mmol/l試劑II緩衝液 120mmol/l核苷磷酸酶 10000U/l黃嘌呤氧化酶 10000U/l過氧化氫酶 10000U/l醛脫氫酶 10000U/l穩定劑 50％(總體積)試劑III緩衝液 120mmol/l肌苷單磷酸 5mmol/l穩定劑 50mmol/l在全自動生化分析儀上設定溫度25℃，反應時間20分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
具體測定步驟為肌苷單磷酸+水5′-核苷酸酶肌苷+單磷酸肌苷+單磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應物置於生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
各反應步驟的反應時間控制在20分鐘。
實施例四本實施例的5′-核苷酸酶診斷試劑有試劑I緩衝液 100mmol/l單磷酸鹽5mmol/l核苷磷酸酶 12000U/l黃嘌呤氧化酶12000U/l乙醇8mmol/l過氧化氫酶 12000U/l氧化型輔酶 3mmol/l醛脫氫酶12000U/l穩定劑 50％(總體積)試劑II
緩衝液 100mmol/l腺苷單磷酸 3mmol/l穩定劑 40mmol/l在生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應，延遲時間1分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值-4180。
加入樣品和試劑後，使之混合，發生以下反應肌苷單磷酸+水5′-核苷酸酶肌苷+單磷酸肌苷+單磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應物置於生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
總之，實驗證明，採用本發明的測定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好，不受內、外源物質的汙染。
權利要求
1.一種5′-核苷酸酶活性測定方法，步驟如下1)、將樣品與主要由肌苷單磷酸、單磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、乙醇、過氧化氫酶、氧化型輔酶、醛脫氫酶組成的試劑混合，使之發生如下反應肌苷單磷酸+水5′-核苷酸酶肌苷+單磷酸肌苷+單磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸鹽+過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子2)、檢測最終反應物在主波長340nm吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
2.根據權利要求1所述5′-核苷酸酶活性測定方法，其特徵在於所述步驟2)為，將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm，吸光度下降的速度，測算出5′-核苷酸酶的活性大小。
3.根據權利要求1或2所述測定5′-核苷酸酶活性的方法，其特徵在於溫度控制在20℃到50℃範圍，反應時間控制在2-30分鐘。
4.根據權利要求1或2所述測定5′-核苷酸酶活性的方法，其特徵在於被測5′-核苷酸酶樣品與試劑的比例控制在1/10到1/250。
5.一種5′-核苷酸酶診斷試劑盒，由以下成分組成緩衝液40--200mmol/l肌苷單磷酸 1--50mmol/l單磷酸鹽 0.2--10mmol/l核苷磷酸酶 500--50000U/l黃嘌呤氧化酶 500--50000U/l乙醇 1--30mmol/l過氧化氫酶 500--50000U/l氧化型輔酶 0.5--20mmol/l醛脫氫酶 500--50000U/l穩定劑 10--80％(總體積)
6.根據權利要求5所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特徵在於所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據權利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特徵在於所述穩定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨或鹽中的至少一種。
8.根據權利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特徵在於所述緩衝劑的pH範圍是6.0-11.0，所述緩衝劑是三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、三乙醇胺緩衝液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩衝液、咪唑緩衝液或雙甘氨肽緩衝液中的一種。
9.根據權利要求5或6所述5′-核苷酸酶診斷試劑盒，其特徵在於所述氧化型輔酶是NADP+、NAD+或thio-NAD+氧化型煙醯胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發明涉及一種測定5′－核苷酸酶活性的方法，同時本發明還涉及5′－核苷酸酶診斷試劑盒，屬於醫學檢驗測定技術領域。該試劑盒包括緩衝液、肌苷單磷酸、單磷酸鹽、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、乙醇、過氧化氫酶、氧化型輔酶、醛脫氫酶、穩定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生酶偶聯反應，再將最終反應物置於生化分析儀下，檢測主波長吸光度變化的情況(速度)，從而測算出5′－核苷酸酶的活性大小。採用本發明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好，不受內外源物質的汙染，便於推廣應用。
文檔編號C12Q1/32GK1760369SQ20041006490
公開日2006年4月19日 申請日期2004年10月11日 優先權日2004年10月11日
發明者王爾中 申請人:王爾中