二倍體細胞乙型腦炎疫苗及純化乙型腦炎疫苗的製備方法
2023-07-26 04:55:21
專利名稱：二倍體細胞乙型腦炎疫苗及純化乙型腦炎疫苗的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種乙型腦炎的純化疫苗的製備方法，特別是在人二倍體細胞上 接種乙腦病毒毒種得到的乙型腦炎純化疫苗的製備方法。
背景技術：
目前世界上大量生產的乙腦疫苗有三種，第一種是以日本為代表的用感染乙 腦病毒的小白鼠腦組織經過研磨、乳化、濃縮、超速離心製備的純化乙腦疫苗； 第二種是中國生產的原代地鼠腎細胞培養的乙腦滅活疫苗和原代地鼠腎乙腦活 疫苗，這兩種疫苗的細胞基質均來源於普通級動物，無法保證不攜帶外源因子； 第三種是北京生物製品研究所以Vero細胞為培養基質生產的凍幹乙腦純化滅活 疫苗，但不能保證細胞基質的致腫瘤和細胞的DNA。
中國專利2004100581129描述了一種人二倍體細胞-WI-38乙型腦炎純化疫苗， 該疫苗的製備採用的細胞營養液由199培養液加入2-10%牛血清配製而成。 無血清培養基(Serum-free Media)被廣泛的應用於培養哺乳動物和無脊椎動物 細胞以製備單克隆抗體、病毒抗原和重組蛋白等。無血清培養基必須能夠滿足細 胞的一系列營養及生理需求，而通常情況下這些營養及生理需求是由加入到培養 基中的血清來予以提供的。大多數的無血清產品含有向細胞內轉運離子的轉鐵蛋 白和調節葡萄糖攝取量的胰島素，以及一些蛋白質如清蛋白、纖連蛋白、胎球蛋 白等，這些蛋白在細胞培養中發揮各種不同功能，如吸附毒性化合物，抗生物反 應器剪切力，提供細胞貼壁所需的基質，作為脂類和其他生長因子的載體等。 本發明意外的發現，通過使用無血清培養基培養人二倍體細胞乙腦純化疫苗，可 使過敏反應大大降低，同時有利於純化。
發明內容
本發明提供一種人二倍體細胞乙腦純化疫苗的製備方法。 本發明採用人二倍體細胞-WI-38來製備乙型腦炎純化疫苗，該疫苗是在人 二倍體細胞上接種乙腦病毒毒種，經分離純化得到的乙型腦炎疫苗。所述乙腦病 毒毒種選自乙腦鼠腦毒種Ps株或SA14-14-2株。本發明的疫苗是凍幹注射劑或
水針劑。
本發明的疫苗的製備方法，包括以下步驟
(1) 、人用二倍體細胞的復甦；
(2) 、人用二倍體細胞的培養擴增；
(3) 、在人用二倍體細胞上接種乙腦病毒毒種；
(4) 、收穫病毒液；
(5) 、病毒液的滅活；
(6) 、澄清超濾；
(7) 、純化；
(8) 、稀釋分裝。
所述人用二倍體細胞的培養擴增是在細胞營養液中進行的，細胞營養液由無 血清培養液組成。可以補充適量的抗生素。所述人二倍體細胞的培養擴增是在轉 瓶內培養，培養方式為微載體培養、懸浮培養或細胞袋培養。
在本發明的乙腦純化疫苗的製備工藝中，細胞培養所用的培養基是無血清培
養基，採用純化超濾純化初步純化，蔗糖密度梯度離心法和S印harose 4FF凝膠 過濾層析進行更純提純。測試結果表明，經過本發明的三步提純後，可使疫苗總 蛋白含量減少約99%以上，疫苗免疫效果大大提高，副反應大大降低，加入氫氧 化鋁佐劑後使疫苗的效價提高20%，穩定性同時大大提高，接種時減緩病毒釋放 的速度，保持良好的抗體水平。通過純化疫苗加入佐劑能增加疫苗的持久性，疫 苗能夠持久刺激機體產生抗體。
本工藝提供的人二倍體乙型腦炎純化疫苗，是指在人二倍體細胞上接種乙腦 病毒毒種得到的乙型腦炎純化疫苗。本工藝具體的製備方法包括以下步驟
(1) 、人二倍體細胞的復甦；
(2) 人二倍體細胞的培養擴增；
(3) 、在人二倍體細胞上接種乙腦病毒毒種；
(4) 、收穫病毒；
(5) 、滅活病毒製成粗疫苗；
(6) 澄清過濾；
(7) 、超濾純化；
(8) 、蔗糖密度梯度離心；(或DEAE-SepharoseFF陰離子交換)
(9) 、 S印harose4FF柱層析純化；
(10) 、佐劑吸附加保護劑人血白蛋白(或不加佐劑吸附)
(11) 、稀釋分裝。
本工藝使用的人二倍體細胞種來源於中國疾病預防控制中心，首先建立細人 二倍體細胞種子庫和人二倍體細胞工作庫，並對細胞庫細胞進行系統的檢定。在 製備疫苗之前，需先進行細胞的復甦、培養和擴增，以達到生產批量的需要。可 使用無血清培養基補充適量的抗生素配製而成的細胞營養液，培養條件為 PH7, 0-7. 6在37±0. 5°C溫度下進行培養擴增。
各種用於製備疫苗的哺乳動物細胞均為附著依賴性細胞，細胞在一定的載體 上生長，本工藝中細胞的培養方式為轉瓶培養，包括微載體培養、懸浮培養、細 胞袋培養。
為防止細菌汙染，在配製細胞營養液的同時可加入適量的卡那黴素或慶大黴素。
培養過程中，細胞分種率根據生產批量的需要確定， 一般可以是l: 2-1: 4 當細胞長成緻密單層後，即可接種乙腦病毒，細胞維持液中最好加入
0.4-0.5。/。(w/w)的人血白蛋白，同時調整PH7.2-7.8，培養溫度32-37。C，並可加 入適量的胺基酸和抗生素，可供使用的無血清培養液選自 UltraCULTURETM培養基(通用無血清培養基)
12-725F UltraCULTURE MEDIUM (Serum-free general purpose medium) 500 ml 988.80
PC-1TM培養基(通用無血清培養基)
77232 PC-1 Complete Serum-Free Medium 2x500ml 2， 206. 26
77230 PC-l Complete Serum-Free Medium (powder plus supplement) 10 L
12, 566. 00
344022 PC-1 Supplement (50X) 10 ml 875.50 UltraMEM Reduced Serum培養基(通用無血清培養基)
12-745F UltraMEM Reduced Serum Medium (Protein-free basal medium without L-glutamine) 500 ml 449. 08
12-743F UltraMEM Reduced Serum Medium (Low-protein medium containing L-glutamine & ITES) 500 ml 519.12 X-VIVOTM無血清培養基
04-380Y X-VIVOTM 10(with Gentamycin and phenol red) 1 liter 1386.38 04-380Q X-VIVOTM lO(with Gentamycin and phenol red) 1 liter 1386.38 08-022A X-VIVOTM 10(with Gentamycin) 4 liter 6241.80
04-743Q X-VIVOTM 10(without Gentamycin or phenol red) 1 liter 1948.76 04-418Y X-VIVOTM 15 (with Gentamycin) 1 liter 1643.88
04-418Q X—VIVOTM 15 (with Gentamycin and phenol red) 1 liter 1602.68 08-055B X-VIVOTM 15 (with Gentamycin) 10 liter 16020.62 04-744Q X-VIVOTM 15 (without Gentamycin & phenol red) 1 liter 1831.34
04-448Q X-VIVOTM 20 (with Gentamycin and phenol red) 1 liter 1643.88
然後在已經生長成緻密單層的人二倍體細胞上接種乙腦病毒毒種 MOI0. 1-0. 00001及上述細胞維持液，培養72小時左右，即可收穫病毒。
本工藝在人二倍體細胞上接種的乙腦病毒為在傳代的人二倍體乙腦病毒種， 有實驗結果顯示，乙腦病毒在人二倍體細胞上能夠很好地生長繁殖，在人二倍體 細胞傳代乙腦病毒IO代以內很穩定，並且製備人二倍體細胞乙腦疫苗方面，10 代以內的細胞傳代毒種的免疫原性沒有明顯改變，而io代以後的毒種的免疫原 性則有明顯的下降，也就是說，製備疫苗最好選用10代以內的傳代毒種，10代 以後的毒種不宜用於製備純化疫苗。至於毒種則優選乙腦鼠毒種P3株在人用二 倍體細胞的傳代毒種。
乙腦病毒在人二倍體細胞上的生長繁殖可維持較長時間，因此病毒的收穫可 採取多次收取的方式，最好是第3-4天收穫一次，對收穫的病毒液及時測定病毒 滴度，要求每批所收穫病毒液病毒滴度均應在107LD50/ml以上，因為只有高滴 度的病毒液才能保證疫苗的高效力。
收穫的病毒液用甲醛溶液或e -丙內酯滅活病毒得到的是粗疫苗。滅活後的粗疫苗需要進行濃縮提純製備成純疫苗製品，本工藝選用 Sepharose中空纖維純化超濾的方法對得到的粗疫苗進行濃縮， 一般是用截留10 萬-30萬分子量的超濾器濃縮疫苗，濃縮至20倍以上，然後純化疫苗。
以人用二倍體細胞製備生物製品安全性的關鍵是雜蛋白的含量。疫苗的總蛋 白量必須小於15ug/ml。有關疫苗的純化方法包括化學法和物理方法等可以有多 種，經反覆試驗和研究，本工藝提出純化方法超濾純化、超離純化和S印harose 4FF柱層析純化。
超濾純化疫苗即把疫苗超濾濃縮到一定倍數，然後加入適量的PBS衝洗，再 深縮到原倍數，再加入適量的PBS衝洗如此反覆5-6次，雜蛋白可以去除93%以 上，再經過蔗糖密度梯度離心法參考石慧穎1998年發表的大規模區帶離心純化 的方法純化Vero細胞乙腦疫苗的方法，用36%和45% (W/V)蔗糖溶液作密度梯 度，23000rpm超速離心4小時後,經過對紫外吸收峰的抗原含量，蛋白濃度的分 析，確定病毒抗原所在位置。然後再經過S印harose4FF純化，而凝膠過濾層析 是層析技術中最簡單，條件最溫和，對保持生物大分子的活性最有利的方法，適 合分離分子量懸殊的物質，乙腦病毒的分子量在400萬以上，與疫苗中的雜蛋白 分子量相差較大，故使用凝膠柱層析可以非常方便有效地去除疫苗中殘留的小分 子雜質，該凝膠過濾柱可以是S印harose 4FF柱或其他凝膠，而檢測結果表明， 經三歩層析柱純化後，疫苗總蛋白含量減少約99%以上，而且比規程所要求的含 量更低。純化疫苗製成成品(即水針劑型)，加入保護劑人血白蛋和氫氧化鋁佐 劑。用人二倍體細胞作為疫苗的生產基質，並且以人二倍體細胞的傳代毒種代替 現有的鼠腦組織毒種，通過相應的工藝方法生產製備出高質量的乙腦疫苗。用本 工藝製備的乙型腦炎純化疫苗中不含鼠腦組織，純度高，免疫效果大大提高，使 用安全性高，並能實現乙腦疫苗的大規模工業化生產。
本工藝製備的疫苗經提純後抗原活性明顯提高，雜蛋白減少99%以上，疫苗 的純度大大提高。
具體實施方式
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以下通過實施例進一步說明本發明。 實施例1
二倍體細胞來自中國疾病預防控制中心，使用38-50代，細胞營養液為無血
清培養基中加入25IU/ml慶大黴素或25IU/ml卡那黴素，並調整PH到7.2,用 3L轉瓶37"C培養成緻密單層後按照1: 2分種率擴增，擴增到生產批量時，經過 4天左右，當細胞長成緻密單層，棄去細胞營養液，接種二倍體細胞乙腦病毒， 使用乙腦鼠腦毒種P:,株在二倍體細胞上傳代的第二代工作毒種(Pw)，毒種濃度 M0I0. 05，細胞維持液為含0, 4-0. 5M(W/W)人白蛋白的199培養液，PH7, 6， 35。C下 培養，24小時後換以新鮮細胞維持液繼續培養2天，開始收穫病毒，每3-4天 收穫一次，共收5次，每批病毒液均取樣進行病毒滴定和無菌試驗，要求收穫病 毒液的病毒滴度達到107LD50/ml以上;合併病毒液加入甲醛溶液或P-丙內酉旨(終 濃度1/2000)置於26土rc， 8天滅活病毒，得到粗疫苗，用截留30萬分子量的 超濾器濃縮成20倍濃縮疫苗。
超濾純化的濃縮疫苗蔗糖密度梯度離心法和凝膠過濾柱S印harose 4FF， 經三步純化，得到純化疫苗，加入人血蛋白保護劑和氫氧化鋁佐劑製成純化疫苗 成品，分裝，製成乙型腦炎純化疫苗為水針劑型5ml或其他規格。
檢定疫苗效力達到了中國乙腦疫苗參考品和日本乙腦疫苗參考品要求，其 他各項檢定均合中華人民共和國藥典標準2005版生物製品規程的疫苗要求。 實施例2
二倍體細胞來自中國疾病預防控制中心，使用38-50代，細胞營養液為無血 清培養基中加入25IU/ml慶大黴素和25IU/ml卡那黴素，並調整PH到7. 2，用 3L轉瓶37nc培養成緻密單層後按照l: 2分種率擴增，擴增到生產批量時，經過 4天左右，當細胞長成緻密單層，棄去細胞營養液，用PH7. 2的Earl's液衝洗細 胞面，接種二倍體細胞乙腦病毒，使用乙腦鼠腦毒種AS14-14-2株在二倍體細胞 上傳代的第二代工作毒種(P:,-2)，毒種濃度MOI0.05,細胞維持液為含 0. 4-0. 5%(\￥/\0人白蛋白的199培養液，PH7. 6， 350C下培養，24小時後換以新鮮 細胞維持液繼續培養2天，開始收穫病毒，每3-4天收穫一次，共收5次，每批 病毒液均取樣進行病毒滴定和無菌試驗，要求收穫病毒液的病毒滴度達到 107LD50/ml以上；合併病毒液加入甲醛溶液或e-丙內酯(終濃度1/2000)置於 26土1"C， 8天滅活病毒，得到粗疫苗，用截留30萬分子量的超濾器濃縮成20 倍濃縮疫苗。
超濾純化的濃縮疫苗過蔗糖密度梯度離心法和凝膠過濾柱S印harose 4FF，
經三步純化，得到純化疫苗，加入人血蛋白保護劑和氫氧化鋁佐劑製成純化疫苗 半成品，分裝，製成乙型腦炎純化疫苗為水針劑型2ml或其他規格。
檢定疫苗效力達到了中國乙腦疫苗參考品和閂本乙腦疫苗參考品要求，其他 各項檢定均合中華人民共和國藥典標準2005版生物製品規程的疫苗要求。
實施例3
用權利要求1方法製備的乙腦滅活疫苗經實驗(包括給12名4-6歲兒童注 射，未接種過乙腦疫苗者，接種2針乙腦滅活疫苗，兩針間隔7 — 10天。)證明 中和抗體陽轉率為91.7%，無副反應發生。
實施例4
用權利要求1方法製備的乙腦滅活疫苗經實驗給58名4-6歲兒童注射，未 接種過乙腦疫苗者，接種2針乙腦滅活疫苗，兩針間隔7 — 10天，過敏反應為O
而用2004100581129專利描述的方法製備的乙型腦炎純化疫苗(注該疫苗 的製備採用的細胞營養液由199培養液加入2-10%牛血清配製而成)給45名兒 童注射，有兩名兒童出現紅腫。
權利要求
1、一種人用二倍體細胞乙型腦炎純化疫苗的製備方法，包括(1)、人用二倍體細胞的復甦；(2)、人用二倍體細胞的培養擴增；(3)、在人用二倍體細胞上接種乙腦病毒毒種；(4)、收穫病毒液；(5)、病毒液的滅活；(6)、澄清超濾；(7)、純化；(8)、稀釋分裝步驟，其特徵在於，其中步驟(2)所述人用二倍體細胞的培養擴增是在細胞反應罐中進行，培養方式為微載體培養、懸浮培養或細胞袋培養，採用無血清培養基作為培養液，培養條件為PH7.0-7.6，溫度在37±0.5℃。
2、 權利要求1的製備方法，其特徵在於，所述無血清培養基是通用無血清培養 基。
3、 權利要求1的製備方法，其特徵在於，所述無血清培養基含有抗生素慶大黴 素和卡那黴素。
4、 權利要求l的製備方法，其特徵在於，其中培養條件PH為7.2。
全文摘要
本發明涉及一種二倍體細胞乙型腦炎疫苗及純化乙型腦炎疫苗的製備方法，該方法使用無血清培養基培養人二倍體細胞乙腦純化疫苗，可使過敏反應大大降低，同時有利於純化。
文檔編號A61K39/12GK101352569SQ200710129799
公開日2009年1月28日 申請日期2007年7月27日 優先權日2007年7月27日
發明者棟 崔 申請人:棟 崔