一種高效去除腐殖質的環境樣品總dna提取方法

2023-08-03 01:56:01 2

專利名稱：一種高效去除腐殖質的環境樣品總dna提取方法
技術領域：
本發明涉及一種高效去除腐殖質的環境樣品總DNA提取方法，屬於生物技術領域。
背景技術：
土壤基因組DNA提取是環境宏基因組學研究的基礎。可以通過兩種途徑實現土壤 DNA的提取，一是在裂解細胞前將土壤中的微生物細胞與土壤顆粒等分開，然後再裂解細胞，獲得總DNA ；二是直接裂解細胞，從土壤中提取總DNA，這種途徑獲得的總DNA產量大，但純度低，主要是腐殖酸等雜質的影響。目前，土壤DNA提取方法多，如液氮研磨法、微波破碎法、玻璃珠裂解法、酶裂解法、快速凍融法、離子交換法、溶劑-玻璃珠混勻法、SDS-玻璃珠法、SDS-GITC-PEG法、MS法、 Nycodenz 法、Blending 法、UltraClean Soil DNA kit (MoBio Laboratories, Inc. , Solana Beach, Calif. )、Fast DNA spin sample kit (for soil ；Bio 101, Lajolla, Calif.)等，所有這些方法要解決的關鍵問題是去除腐殖酸以及如何從裂解的細胞中提取總DNA。上述方法直接提取土壤總DNA的純度低，需要後續的純化步驟，費時費力。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種高效去除腐殖質的環境樣品總DNA提取方法。高效去除腐殖質的環境樣品總DNA提取方法，包括以下步驟(1)取0.3g過篩的土樣於裝有三顆2. 5mm-3. Omm滅菌玻璃珠的2mL的離心管中，加入ImL脫腐緩衝液 (IOOmmol/L Tris,100mmol/L Na4P2O7,IOOmmo1/L Na2EDTA,1. O % PVP,lOOmmol/LNaCl, 0. 05% Triton X_100，pH 10. 0), Vortex-Genie 2 (Mobio Laboratories Inc)渦旋 lmin， 12000r/min 離心 2min，棄上清；(2)力口入 ImL 0. 5mol/L 的氣化 丐溶液，Vortex—Genie 2 (Mobio Laboratories Inc)渦旋 2min, 12000r/min 離心 lmin，棄上清；(3)力口入 800yL DNA 提取緩衝液(lOOmmol/L Tris-HCl, 1. 5mol/L NaCl, 1 % CTAB, ρΗ 8. 0)，Vortex-Genie 2 (Mobio Laboratories Inc) y^M 5s ；(4)加入200yL SDS溶液(20% )，顛倒混勻，65°C溫育lOmin，5min顛倒混勻一
次。；(5)取上清900yL於2mL離心管中，加入等體積的酚氯仿異戊醇 (25 24 1)，12000r/min 離心 5min ；(6)取上清SOOyL於2mL離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇(24 1)， 12000r/min 離心 5min ；(7)取上清600yL於1.5mL離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，冰浴20min， 12000r/min 離心 5min ；
(8)棄上清，用70%的酒精洗沉澱，自然乾燥或冷凍乾燥；(9) 50 μ L TE 溶解沉澱。去除腐殖酸是土壤總DNA提取的重要環節，步驟1-3協同作用，能高效去除腐殖酸，提高土壤總DNA提取純度。高效去除土壤中腐殖酸，提高總DNA提取純度，為土壤宏基因組學研究提供基礎技術。


圖1為本發明方法提取4種不同土壤微生物基因組DNA電泳圖(3個重複)；圖2為本發明方法提取4種不同土壤微生物AOB基因組amoA基因片段擴增電泳圖；圖3為本發明方法提取4種不同土壤微生物AOA基因組amoA基因片段擴增電泳圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實驗土壤供試土樣採集於內蒙古高原錫林河流域中遊，包括典型草原圍封區土壤-1、退化草原區土壤-2、錫林河高河漫灘區溼地土壤-3和低河漫灘區溼地土壤_4試驗土樣，分別記為W1、W2、W3、W4。採集深度0-10cm，四種土壤樣品的部分理化性質見表1。
權利要求
1. 一種高效去除腐殖質的環境樣品總DNA提取方法，其特徵在於，包括以下步驟(1) 取0. 3g過篩的土樣於裝有三顆2. 5mm-3. Omm滅菌玻璃珠的2mL的離心管中，加入ImL脫腐緩衝液(IOOmmol/L Tris, 100mmol/L Na4P2O7, IOOmmo 1/L Na2EDTA, 1. 0% PVP, 1 OOmmo 1/L NaCl, 0. 05% Triton X-100, ρΗ 10. 0), Vortex-Genie 2 (MobioLaboratories Inc)禍旋 lmin, 12000r/min 離心 2min，棄上清；(2)力口入ImL 0. 5mol/L 的氣化 丐溶液，Vortex-Genie 2 (Mobio Laboratories Inc) 渦旋2min, 12000r/min離心lmin，棄上清；(3)加入800yL DNA 提取緩衝液(100mmol/L Tris-HCl, 1. 5mol/L NaCl, 1% CTAB,pH 8. 0), Vortex-Genie 2 (Mobio Laboratories Inc)禍旋 5s ；(4)加入200μ L SDS溶液(20% )，顛倒混勻，65°C溫育lOmin，5min顛倒混勻一次。；(5)取上清900μL於2mL離心管中，加入等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1)， 12000r/min 離心 5min ；(6)取上清800μ L於2mL離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇(24 1), 12000r/min 離心5min ；(7)取上清600μ L於1. 5mL離心管中，加入0. 6倍體積的異丙醇，冰浴20min, 12000" min 離心 5min ；(8)棄上清，用70%的酒精洗沉澱，自然乾燥或冷凍乾燥；(9)50 μ L TE溶解沉澱。
全文摘要
本發明公開了高效去除腐殖質的環境樣品總DNA提取方法，包括以下步驟(1)取0.3g過篩的土樣於裝有三顆2.5mm-3.0mm滅菌玻璃珠的2mL的離心管中，加入1mL脫腐緩衝液，Vortex-Genie2(Mobio Laboratories Inc)渦旋1min，12000r/min離心2min，棄上清；(2)加入1mL 0.5mol/L的氯化鈣溶液，Vortex-Genie2(MobioLaboratories Inc)渦旋2min，12000r/min離心1min，棄上清；(3)加入800μL DNA提取緩衝液，Vortex-Genie2(Mobio Laboratories Inc)渦旋5s。快速高效提取土壤總DNA，為土壤宏基因組學研究提供高純度基因組DNA。
文檔編號C12N15/10GK102286463SQ20111017877
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月29日 優先權日2011年6月29日
發明者於景麗, 李靖宇, 武琳慧, 趙吉 申請人:內蒙古大學