兒童鈣需求遺傳檢測的製作方法

2023-06-24 09:54:46

專利名稱：兒童鈣需求遺傳檢測的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域，更具體的，本發明涉及一種通過遺傳檢測指 導兒童個體化補鈣的方法。
背景技術：
鈣是人體內含量最多的礦物元素，廣泛存在於身體的各個部分。絕大多數鈣元素 沉積於骨骼和牙齒中，既組成人體的支架，又是機體內鈣元素的儲存庫，而只有1 %的鈣存 在於人體的軟組織、細胞外液及血液中。因此，長期鈣攝入不足，機體勢必動用大量的骨鈣 來維持體液鈣的水平，不但影響到兒童的正常生長發育，還可導致兒童時期的佝僂病。膳食營養中的攝入的鈣質並不全能被人體吸收利用，被腸道吸收後通過血循環沉 積到骨骼中，還有的部分經腸道、腎臟等途徑排出體外。在這一系列過程中，不僅與多種營 養元素相互作用，還受到多種激素的調控。遺傳因素的影響也是一個重要方面，不同基因 型的人群鈣吸收代謝能力存在差異，部分人群可能需要更高的攝入量才能滿足自身的鈣需 求。鈣營養檢測手段有膳食鈣調查，血清鈣、磷、鹼性磷酸酶測定，尿鈣測定，血清 25- (OH) D3水平測定和骨密度測定等。血清鈣由於體內多種調控機制，保持在一個恆定的範 圍內，嚴重缺鈣才能顯示出來。骨鹼性磷酸酶(BALP)是由成骨細胞合成的，當骨鈣化不足 時，成骨細胞活躍，BALP活性上升，其改變先於影像變化，但它不能反映機體的營養狀況。尿 鈣濃度不穩定，除非同時測血肌醇和尿肌醇或測M小時混合尿鈣，血清25-(0H)D3水平測 定要求實驗室條件高，一般醫院難以普遍進行。骨密度測定是一項方便、敏感、準確、無創， 能反映骨骼礦物營養，特別是鈣營養的指標，因為體內99%以上的鈣都沉澱在骨骼和牙齒 中，但這一檢查手段一般多用於成人。因此，目前鈣營養檢測手段有其局限性，仍需要一種 更完善的檢測手段來指導兒童補鈣。VDR (1, 25-dihydroxyvitamin D3 rec印tor)基因編碼維生素D3的核激素受體，該 蛋白也是膽石酸的第二受體。VDR屬於反式轉錄調控因子，為類固醇激素/甲狀腺類激素 受體超家族的成員。該核激素受體的下遊靶點主要涉及礦物質代謝通路，以及免疫反應和 腫瘤激活等一系列代謝通路。該基因的多態性會導致維生素D缺乏引起的佝僂病。對VDR 基因多態性與疾病、骨代謝、生長發育及腫瘤相關性的研究，一直是學者們關注的熱點。研 究表明I位點多態性對少年兒童骨鈣代謝方面的影響，該多態位點與鈣吸收、BMC(骨 礦含量)、BMD均顯著相關，FF型更為有利，而 基因型在鈣吸收和積累方面低於FF型約 20%。同樣，有研究證實Bsm I位點與1 6歲兒童骨密度顯著先關，恥型BMD明顯低於ΙΛ 型，差異具有顯著性。PTH基因編碼甲狀旁腺激素，是通過甲狀旁腺細胞合成並分泌的由84 個胺基酸組成的多肽激素。甲狀旁腺激素能夠通過促進骨鈣溶解釋放和抑制排洩來提高血 鈣濃度，影響體內質鈣與磷的代謝。甲狀旁腺功能失調會引起血中鈣與磷的比例失常。PTH 基因與骨密度個體差異相關的研究較多的集中在BstBI位點，BstB I多態位點中B等位基 因型可能對維持骨量具有一定的作用。IL-6是由成骨細胞和單核細胞合成的骨吸收細胞因子，作用於破骨細胞前體刺激其增殖和分化，參與骨質疏鬆症的發病。在骨重建過程中，成 骨細胞起著非常重要的作用，IL-6可以通過多種途徑對成骨細胞的增殖分化和凋亡起調節 作用。rsl800795位點為IL-6基因調節區-174位的G/C變異，可能改變IL-6的轉錄，並且 認為變異可能與骨質疏鬆、慢性關節炎、風溼性關節炎、動脈粥樣硬化以及腦神經性疾病密 切相關。為了更合理和有針對性的指導鈣質補充，減少兒童因鈣攝入不足而導致的骨量丟 失和骨骼生長障礙等相關疾病以及防止過度補鈣，利用現代科學研究成果，開發一項基於 分子遺傳基礎的兒童鈣需求遺傳檢測項目會對鈣攝入補充的個體化應用產生積極的提示 作用，具有很強的社會意義和市場前景。

發明內容
本發明提供一種兒童個體化補鈣的遺傳檢測方法。通過採集受檢者的口腔黏膜細胞，提取其基因組DNA，對其基因組DNA的VDR基因 Fok I位點、VDR基因Bsm I位點、PTH基因BstB I位點和IL-6基因-174G/C位點多態性 進行檢測，從基因層面評估個體對於鈣需求的差異，指導合理補充鈣質，提高兒童鈣營養， 避免在鈣缺乏達到嚴重程度導致疾病發生時才進行治療或者過度補鈣。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未註明具體條件的實驗 方法，通常按照常規條件，或按照廠商所建議的條件。實施例檢測試劑盒的使用步驟1:DNA模板的抽取用矽膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。步驟2 螢光定量PCR反應使用檢測試劑盒中的螢光定量PCR套裝，進行螢光定量PCR反應，反應的體系為總 體積10 μ 1，包含濃度為20ng/ μ 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX螢光定量PCR反應緩衝液、 0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mM MgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA 聚合 酶、20 μ M的有義引物和反義引物各0. 225 μ 1、10 μ M的帶VIC螢光探針和帶FAM螢光探針 各0.25 μ 1，去離子水5. 325 μ 1。在PCR擴增儀上進行反應，反應條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進行60個循環 的95°C、30秒，60°C、1分鐘。反應結束後在螢光定量PCR儀上讀取樣品螢光量。步驟3:基因型分析根據試劑盒使用說明書標示的基因分型圖示對SNP位點進行基因型分析。熟悉螢光定量PCR技術的本領域技術人員能夠通過辨識螢光定量PCR儀上顯示 的最終樣品螢光量，根據不同序列探針螢光信號的強弱即可確定所檢測的SNP位點的基因 型。
權利要求
1.一種兒童個體化補鈣的遺傳檢測方法，其特徵在於採集受檢者的口腔黏膜細胞， 提取其基因組DNA，對其基因組DNA的VDR基因I位點、VDR基因Bsm I位點、PTH基因 BstB I位點和IL-6基因-174G/C位點多態性進行檢測，從基因層面評估個體對於鈣需求的 差異，指導合理補充鈣質，提高兒童鈣營養，避免在鈣缺乏達到嚴重程度導致疾病發生時才 進行治療或者過度補鈣。
2.一種檢測檢測葉酸代謝障礙的試劑盒，包括特異性引物對及特異性螢光探針對，Taq 酶，dNTP混合液，MgC12溶液，螢光定量PCR反應緩衝液和去離子水，其特徵在於所述的特 異性引物對及特異性螢光探針對是針對VDR基因I位點、VDR基因Bsm I位點、PTH基 因BstB I位點和IL-6基因-174G/C位點多態性設計的。
全文摘要
本發明公開了一種兒童個體化補鈣的遺傳檢測方法和檢測用試劑盒，通過採集受檢者的口腔黏膜細胞，提取其基因組DNA，對其基因組DNA的VDR基因Fok I位點、VDR基因Bsm I位點、PTH基因BstB I位點和IL-6基因-174G/C位點多態性進行檢測，從基因層面評估個體對於鈣需求的差異，指導合理補充鈣質，提高兒童鈣營養，避免在鈣缺乏達到嚴重程度導致疾病發生時才進行治療或者過度補鈣。
文檔編號C12Q1/68GK102108385SQ200910200489
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月23日 優先權日2009年12月23日
發明者馮哲民, 賀憲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司