孔雀石綠殘留的酶聯免疫檢測試劑盒及其使用方法

2023-07-25 01:42:01

專利名稱：：孔雀石綠殘留的酶聯免疫檢測試劑盒及其使用方法
技術領域：
：本發明涉及酶聯免疫檢測
技術領域：
，具體涉及一種動物源性食品中孔雀石綠殘留的酶聯免疫檢測試劑盒及其使用方法。技術背景孔雀石綠具有潛在的致癌、致畸、致突變的作用，其在養殖業中的使用未得到美國食品與藥物管理局(FDA)的認可；根據歐盟法案2002/675/EC規定，動物源性食品中孔雀石綠和無色孔雀石綠殘留總量限制為2ug/kg;日本的肯定列表也明確規定在進口水產品中不得檢出孔雀石綠殘留；我國在農業行業標準《NY5071-2002無公害食品魚藥使用準則》中也將孔雀石綠列為禁用藥物。2005年，福建、江西、安徽等省出口歐盟、日本、韓國的鰻魚產品先後被檢出孔雀石綠殘留，我國水產品出口因此受嚴重影響；2006年，上海市場上的多寶魚和香港市場上的桂花魚，也都檢出孔雀石綠殘留。水產品中孔雀石綠的殘留問題日益成為社會關注的焦點。孔雀石綠在水生動物體內會很快代謝成無色孔雀石綠，無色孔雀石綠的毒性甚至超過孔雀石綠。因此，有關法規對動物源性食品中孔雀石綠殘留限量的規定都是以孔雀石綠和無色孔雀石綠的總量為限量指標，要求相關的檢測方法能檢測出孔雀石綠和無色孔雀石綠總量。目前，孔雀石綠的檢測方法以理化檢測法和免疫學檢測法為主。通常，檢測孔雀石綠的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)，氣相色譜一質譜法(GC-MS)、理化檢測法和免疫分析技術(IA)等等。HPLC法與GC-MS法是孔雀石綠殘留檢測的確證方法，其優點是檢測精確度高，但因其儀器化程度高、檢測時間長、過程繁瑣、檢測費用昂貴等而阻礙其推廣應用。理化檢測法多以有機溶劑萃取後過層析柱，然後觀察顏色進行孔雀石綠殘留的判斷，此方法主觀性強，對微量殘留進行很難測定，而且無法定量，因此很難符合檢測單位實際使用的要求。而酶聯免疫分析(ELISA)快速檢測技術因靈敏度高、特異性好、既可定性又可定量，且成本低、操作簡單快速、一次檢測樣本量大、儀器化程度低現已成為常用的篩選方法。檢索相關文獻與專利發現，國內關於孔雀石綠免疫檢測的方法與試劑盒很少，檢索到一篇中國專利《水產品中孔雀石綠間接競爭ELISA檢測試劑盒》(申請號200510060995.1)中提到一種孔雀石綠酶聯免疫試劑盒，此試劑盒採用的檢測原理為，酶標板中包被有孔雀石綠抗原，樣品與包被抗原競爭結合孔雀石綠抗體，洗滌去除未反應試劑，然後再加入酶標記抗抗體反應，再洗滌，加入底物顯色，終止後，讀數；該試劑盒由於採用間接競爭ELISA檢測模式，操作複雜、步驟多，檢測時間長，生產與保存成本高，很難滿足實際應用的需求。總之，現有酶聯免疫試劑盒採用的檢測方法複雜、繁瑣，很難應用於實踐，且現有技術由於普遍存在穩定性差、樣品前處理及檢測步驟複雜、設備條件要求較高、價格昂貴等不足，嚴重影響了孔雀石綠殘留檢測與監控，因此研製穩定性高、操作簡單、設備要求低、廉價的孔雀石綠ELISA試劑盒具有非常重要的經濟和社會意義。
發明內容本發明的目的是針對現有孔雀石綠檢測產品中存在的不足，提供一種高特異性、高靈敏度、價格低廉、操作簡單，能大批量快速檢測孔雀石綠的酶聯免疫試劑盒。本發明的另一目的是提供利用上述酶聯免疫試劑盒檢測孔雀石綠殘留的方法。為了實現上述目的，本發明採用如下測定原理首先將孔雀石綠抗原包被於固相載體，例如酶標板上，然後加入標樣或待測樣品，再加入酶標記孔雀石綠抗體，包被抗原與待測樣品中的孔雀石綠競爭酶標抗體，待測樣品孔雀石綠含量高時，則與固相抗原結合的酶標抗體就少，反之結合在固相抗原上的酶標抗體就多，反應後加入底物進行顯色加以測定，當酶標抗體量一定時，加入的待測樣品含孔雀石綠越多，與固相抗原結合酶標抗體就越少，發色反應減弱，百分吸光度值低，反之，則發色反應增強，百分吸光度增高，因而根據百分吸光度值與孔雀石綠濃度之間的半對數關係作圖即得標準曲線，再根據孔雀石綠的標準曲線和待檢樣品的百分吸光度值，即可推算出待測樣品中孔雀石綠的濃度。本發明的具體技術方案為提供一種孔雀石綠殘留的酶聯免疫檢測試劑盒，包含下列成分(1)包被了孔雀石綠抗原的酶標板；(2)酶標記孔雀石綠抗體工作液；(3)孔雀石綠標準溶液；(4)底物液；(5)底物緩衝液；(6)反應終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)樣品稀釋液。所述酶標板是96孔或40孔酶標板，酶標板孔內包被有能與抗孔雀石綠抗體特異結合的孔雀石綠抗原，其是使用重氮法將孔雀石綠與載體蛋白偶聯得到的，所用的包被液為pH9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩衝溶液，碳酸鹽緩衝溶液含l2g碳酸鈉、24g碳酸氫鈉和雙蒸水1L，封閉液為15%脫脂奶粉溶液。所述孔雀石綠抗體的製備，所用的免疫原為採用重氮法將孔雀石綠半抗原與載體蛋白共價偶聯合成得到的，以免疫抗原免疫兔子或小鼠，製備孔雀石綠多克隆抗體、利用雜交瘤技術製備孔雀石綠單克隆抗體或利用基因工程方法製備基因工程抗體。收集抗血清、腹水、發酵液等，用辛酸硫酸銨沉澱純化或過親和層析柱進行純化。所述酶標記孔雀石綠抗體工作液為採用戊二醛法或過碘酸鹽氧化法將酶與孔雀石綠抗體進行偶聯得到的。所用標記酶可為辣根過氧化物酶或細菌提取鹼性磷酸酯酶，本發明優選為辣根過氧化物酶，且採用改良後的過碘酸鹽氧化法進行標記，提高了標記效率，節省了酶與抗體的用量，保證標記後酶與抗體具有良好的活性。所述孔雀石綠標準溶液的濃度為8.1ug/L、2.7ug/L、0.9yg/L、0.3ug/L、0.1ng/L禾卩0ug/L。所述底物顯色液當標記酶為辣根過氧化物酶時，底物液為含有3，3，5，5—四甲基聯苯胺(TMB)或鄰苯二胺(0PD)的pH5.0磷酸-檸檬酸緩衝溶液，底物緩衝液為含有過氧化氫或過氧化脲的pH5.0磷酸-檸檬酸緩衝溶液，所述終止液為12mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液；當標記酶為細菌提取的鹼性磷酸酯酶時，所述底物液為對硝基磷酸鹽緩衝液，所述底物緩衝液為含有過氧化氫或過氧化脲的pH5.0磷酸-檸檬酸緩衝溶液，所述終止液為12mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液。所述濃縮洗滌液為含0.51.5%吐溫20的磷酸鹽緩衝液，磷酸鹽緩衝液pH7.4，濃度為O.lmol/L,為正常使用濃度的1525倍。所述樣品稀釋液為含O.05X吐溫20的0.01mol/L磷酸鹽緩衝液，磷酸鹽緩衝液pH7.4。可以作為固定孔雀石綠抗原的載體的物質較多，例如聚苯乙烯、硝酸纖維素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯醯胺、交聯葡萄糖、玻璃、矽橡膠、瓊脂糖凝膠等。該載體的形式可以為凹孔、紙片、小珠等。本發明所述抗原抗體的製備方法陳述如下-(1)抗原的合成半抗原的合成用化學方法先合成硝基無色孔雀石綠(N02-LMG)，然後將其還原為氨基無色孔雀石綠(NH2-LMG)，用矽層析法分析兩者的純度，並進行回收。包被原和免疫原的合成將孔雀石綠半抗原和牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鑰孔血藍蛋白(KLH)等載體蛋白，通過重氮化法進行偶聯得到包被抗原與免疫原。免疫原與包被原通過柱層析進行純化，純度經SDS—PAGE電泳鑑定。(2)孔雀石綠單克隆抗體的製備動物免疫以半抗原與載體蛋白偶聯物為免疫原對Balb/c小鼠進行間隔免疫，間接ELISA檢測並得到血液裡含有孔雀石綠特異性抗體的小鼠脾臟。細胞融合與克隆取產生特異性抗體的Balb/c小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP20融合，採用間接競爭酶聯免疫方法測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法或顯微克隆法對陽性孔進行克隆化，得到並建立產單克隆抗體的雜交瘤細胞株。細胞凍存和復甦取處於對數生長期的雜交瘤細胞用凍存液製成細胞懸液，分裝於凍存管，在液氮中長期保存。復甦時取出凍存管，立即放入37。C水浴中速融，離心去除凍存液後，移入培養瓶內培養。單克隆抗體的製備與純化採用體內誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油，714天後腹腔注射雜交瘤細胞，710天後採集腹水。經辛酸一飽和硫酸胺法或親和層析法進行腹水純化，純度經SDS—PAGE電泳鑑定，小瓶分裝，-2(TC保存。(3)孔雀石綠兔多克隆抗體的製備採用紐西蘭大白兔作為免疫動物，以孔雀石綠與載體蛋白偶聯物為免疫原對紐西蘭大白兔進行免疫，多次免疫後測定血清抗體效價，心臟採血，經硫酸胺分級沉澱得到純化的多克隆抗體。(4)孔雀石綠基因工程抗體的製備基因工程抗體主要指小分子抗體，包括Fab(由完整的輕鏈和Fd構成)，Fv(由VH和VL構成)，ScFv(單鏈抗體，VH和VL之間由一條連接肽連接而成)，單域抗體(僅由VH組成)等經基因工程技術改造後的抗體。製備方法為提取孔雀石綠單克隆細胞或經孔雀石綠免疫原免疫後的小鼠脾細胞的RNA，反轉錄為cDNA，設計抗體輕重鏈擴增引物，利用PCR技術擴增出抗體的輕重鏈基因，插入適當的表達質粒，在大腸桿菌中表達，利用免疫親和方法進行純化，純度由SDS-PAGE電泳鑑定。其中，酶標記孔雀石綠抗體的製備-將孔雀石綠抗體與辣根過氧化物酶(HRP)採用過碘酸鈉法進行偶聯。具體方法為①溶解5mgHRP於lmL超純水中，加入新配置的0.lmol/L過碘酸鈉75uL，置室溫或4。C冰箱反應20min或30min。②反應完後裝入透析袋，0.OOlmol/LPH4.0醋酸緩衝溶液4"C透析過夜，期間需更換透析液幾次。③將抗體用0.lmol/L碳酸緩衝液稀釋至10mg/mL，另外用0.lmol/L碳酸緩衝液將活化好的HRP的溶液pH調至9.5。將0.5mL抗體加入HRP溶液中，置室溫或4t:冰箱反應2h。加入100yL4mg/mL硼氫化鈉，4。C冰箱反應2h。⑤對0.01mol/LPBS透析過夜，加入保存液-20。C保藏備用。其中，酶標板的製備方法為用包被緩衝液將孔雀石綠抗原按需要稀釋，向酶聯板微孔中加入抗原稀釋液，放入37t:環境進行孵育，再放入4。C環境中過夜孵育，得到的酶聯板的穩定性好，傾去包被液，用洗滌液洗滌，然後在每孔中加入封閉液，37。C孵育，傾去孔內液體，乾燥後用鋁膜真空密封保存。本發明同時提供了利用上述酶聯免疫試劑盒進行動物源性食品中孔雀石綠檢測的使用方法(1)樣品前處理；(2)使用試劑盒檢測；(3)結果處理與分析。本發明提供待測樣品前處理方法為(1)取剪碎樣品置入離心管中，按每克樣品加入2mL加入乙酸乙酯，充分打碎均質；(2)4000rpm/min離心10min，取上清在50。C水浴下氮氣流吹乾樣品；(3)以等量環己垸和蒸餾水混合提取渦旋l分鐘，取環己烷層，按每克樣品加入12.5uL計加入lMHCL，渦旋1分鐘，靜置30min;(4)加入2倍於HCL液量的蒸餾水，8000rpm/min離心10min，棄去上層環己垸，吸取下層清液，用1NNaOH調整到pH6.08.0與稀釋液進行4倍稀釋後，取50pL進行分析。使用試劑盒檢測的方法為(1)將試劑盒從冷藏環境中取出，置於室溫平衡；(2)將標準品或待測樣品加入已經包被有孔雀石綠抗原的酶標板孔內，然後每孔加入酶標記物，輕拍混勻，孵育；(3)洗滌；(4)每孔加入等量的底物緩衝液與底物液，輕拍混勻，避光孵育；(5)每孔加入反應終止液，混合均勻，在波長450nm或492nm下，以空氣為空白，酶標儀測定各孔吸光值；本發明提供的檢測結果處理與分析方法為以所獲標準樣品吸光值的平均值計算百分吸光度值，以百分吸光度值為縱坐標，孔雀石綠標準溶液濃度的半對數為橫坐標繪製標準曲線，求出直線方程。用同樣的方法計算樣品溶液的百分吸光度值，根據方程式求出對應樣品的孔雀石綠濃度。所述百分吸光度值的計算式為百分吸光度值(%)=(B/B。)X100其中，B為標準溶液或樣品的平均吸光值，Bo為Oug/L標準溶液的平均吸光度值。檢測結果的分析還可以利用計算機專業軟體進行計算與分析，對孔雀石綠線性檢測範圍為0.18.1Pg/L，檢測限為0.1ug/L，整個檢測過程只需35min就可以完成。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明的試劑盒採用直接競爭ELISA檢測模式，採用高特異性、高親合力的抗體，減少了操作步驟，提高了檢測的靈敏度、準確度；採用包被抗原進行酶標板的包被，相對於抗體包被，更有利於達到較好的包被效果與較長的保存時間，從而提高了試劑盒檢測的精密度與穩定性；另外本試劑盒利用酶標記抗體技術，且採用改良後的過碘酸鹽氧化法進行標記，將酶直接標記於孔雀石綠特異性抗體上，將孔雀石綠特異性抗體與酶兩種最重要的反應物合二為一，提高了標記效率，節省了酶與抗體的用量，保證標記後酶與抗體具有良好的活性，不僅大大簡化了操作步驟和反應時間，減少了因操作複雜引起的誤差，而且無需在試劑盒內再配置抗抗體，同時也節約了孔雀石綠特異性抗體與酶的用量，從而大大降低了試劑盒的成本。基於以上優點本試劑盒非常適用於孔雀石綠殘留的痕量分析與批量檢測，具有重要的現實意義。圖1為標準曲線具體實施方式下面結合附圖和具體實施例來進一步詳細說明本發明。實施例l抗原的製備孔雀石綠抗原的製備a.200mg純化的氨基無色孔雀石綠加0.3mol/LHCL12mL的比例，將純化的氨基無色孔雀石綠攪拌溶解；b.在冰浴攪拌的條件下緩慢加入10g/LNaN02，使氨基無色孔雀石綠重氮化，同時監測NaN02是否過量，檢測方法取澱粉/碘化鉀溶液滴於白色乾燥玻璃片上，滴加1滴上述重氮化溶液，混合後30s內呈現藍黑色即完成氨基無色孔雀石綠的重氮化；c.上述重氮化的氨基無色孔雀石綠繼續反應20min，稱取800mg的BSA，溶於碳酸鹽緩衝液，製成20g/L蛋白溶液，在冰浴攪拌條件下緩慢加入重氮化氨基無色孔雀石綠溶液；邊加邊用O.Olmol/LNaOH調節pH至7.58.0，獲得無色孔雀石綠與牛血清白蛋白得偶聯物(LMG-BSA)，置於4'C冰箱過夜；d.於4。C條件下，先用pH值較低的稀HCL(0.01mol/L)溶液透析，然後用0.lmol/LpH7.2的PBS透析3d，每天換透析液3次，分裝凍幹後，一2(TC保存。實施例2抗體的製備孔雀石綠鼠單克隆抗體製備動物免疫程序採用Balb/c小鼠作為免疫動物，以孔雀石綠半抗原與牛血清白蛋白偶聯物為免疫原，免疫劑量為60ug/只，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合製成乳化劑，腹腔注射，間隔3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，四免後腹腔加強免疫一次，3天後取脾細胞。細胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按4:1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，採用間接競爭酶聯免疫方法測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用顯微克隆法對陽性孔進行克隆化，直到得到穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。細胞凍存和復甦取處於對數生長期的雜交瘤細胞用凍存液製成5Xl(^個/mL的細胞懸液，分裝於凍存管，在—7(TC超低溫冰箱中長期保存。復甦時取出凍存管，立即放入37X:水浴中速融，離心去除凍存液後，移入培養瓶內培養。單克隆抗體的製備與純化採用體內誘生法，將Balb/c8周齡的小鼠腹腔注射雜交瘤細胞5乂106個/只，14天後採集腹水。用免疫層析法進行腹水純化，小瓶分裝，-2(TC保存。實施例3辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶的提取1、辣根過氧化物酶的提取a.水提取稱取20千克已洗乾淨的鮮辣根或辣根皮，切成小塊，在粉碎機中絞碎。碎渣漿加10千克水在低溫下攪拌浸提8小時，以3000轉/分速度離心10分鐘，收集上清液。b.硫酸銨分級分離每升濾液加226克硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，置室溫下過夜。次日吸取上清液，再按每升上清液加258克硫酸銨粉末，隨加隨攪拌，待硫酸銨完全溶解後，置冷室過夜。次日吸去上清液，沉澱部分在冷凍離心機中以13000轉/分離心20分鐘，棄去上清液，收集沉澱。將沉澱溶於200300毫升蒸餾水中，分裝於透析袋中，在流動水中透析12天，直至透出的水加入氯化鋇溶液無沉澱生成為止。然後再在蒸餾水中透析8小時。合併透析液，在冷凍離心機中以4000轉/分離心15分鐘，收集上清液。c.丙酮分級分離將上清液倒入燒杯並置冰鹽浴中，在不斷攪拌下，用滴管沿杯壁加入等體積預冷至一i5t:的丙酮，在冷凍離心機中以4000轉/分離心15分鐘，收集上清液，再加入原上清液體積0.8倍的一i5r丙酮，離心(條件同上)收集沉澱。將沉澱溶於少量蒸餾水中，透析(方法同上)除去丙酮，即得粗HRP。d.精製每升粗酶液加入1毫升1摩爾硫酸鋅溶液，在冷凍離心機中以5000轉/分離心10分鐘，收集上清液，分裝於透析袋內，於流水中透析除硫酸鋅，約需1天，然後在蒸餾水中透析8小時。將透析液合併，進行真空乾燥即得精製HRP。產品呈米黃色纖維狀鬆軟物。2、鹼性磷酸酶利用產生鹼性磷酸酯酶的f.6bh'7，317菌株發酵培養，發酵液經離心(8000r/min，10min)後，沉澱的菌體經5X10—4MEDTA—0.03MpH8.0Tris—0.5M蔗糖高滲液處理後用溶菌酶破壁，上清酶液經DEAE纖維素攪拌吸附和洗脫，熱處理和S印hadexG-100分子篩層析純化。實施例4酶標記孔雀石綠抗體的製備辣根過氧化物酶HRP標記孔雀石綠抗體的製備採用過碘酸鹽氧化法，具體方法為a.溶解5mgHRP於lmL超純水中，加入新配置的0.1mol/L過碘酸鈉75uL，置室溫或4。C冰箱反應20min或30min。b.反應完後裝入透析袋，0.001mol/LpH4.0醋酸緩衝溶液4。C透析過夜，期間需更換透析液幾次c.將孔雀石綠抗體用0.lmol/L碳酸緩衝液稀釋至10mg/mL，另外用0.lmol/L碳酸緩衝液將活化好的HRP的溶液pH調至9.5。將0.5mL抗體加入HRP溶液中，置室溫或4。C冰箱反應2h。d.加入100ixL4mg/mL硼氫化鈉，4。C冰箱反應2h。e.對0.01mol/LPBS透析過夜，加入保存液-20。C保藏備用。實施例5酶聯免疫試劑盒組分的配製(1)濃縮洗滌緩衝液的配製含0.51.5%吐溫20的磷酸鹽緩衝液，磷酸鹽緩衝液pH7.4，濃度為0.1mol/L，為正常使用濃度的1525倍。(2)樣品稀釋液的配製pH7.4、0.01mol/L、含有0.05%吐溫20的磷酸鹽緩衝液。(3)封閉液的配製脫脂奶粉1.05.0g溶於100mL蒸餾水。(4)底物緩衝液的配製30%過氧化氫30uL溶於19mL的pH5.0磷酸-檸檬酸緩衝液中，4。C保存。磷酸-擰檬酸緩衝液0.2MNa2HP0425.7mL，0.1M擰檬酸24.3mL，加蒸餾水50mL。(5)底物液的配製將3，3，5，5—四甲基聯苯胺(TMB)80mg溶於10mLPH5.0磷酸-檸檬酸緩衝液中，4'C保存。磷酸-檸檬酸緩衝液0.2MNa2HP0425.7mL，0.1M擰檬酸24.3mL，加蒸餾水50mL。(6)酶標板微孔板的包被包被抗原用pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩衝溶液稀釋成0.15ug/mL，其中碳酸鹽緩衝溶液含12g碳酸鈉和24g碳酸氫鈉以及雙蒸水1L。在酶標板的每孔加100uL，37。C包被lh後4。C下包被過夜，傾去包被液，用PBST洗滌3次，拍幹，然後在每孔中加入200uL1.05.0X脫脂奶粉，放入37。C溫箱中lh後用PBST洗滌3次，乾燥後封入鋁箔袋中4°。保存。(7)孔雀石綠標準溶液的配製準確稱取無色孔雀石綠標樣10mg，溶於0.lmL0.lmol/L鹽酸溶液，然後用樣品稀釋液分別配製8.lug/L、2.7ug/L、0.9ug/L、0.3ug/L、0.1ug/L、Oug/L孔雀石綠溶液，4"C保存。(8)試劑分裝各種試劑按要求配製，測定合格後無菌分裝。酶標記孔雀石綠抗體工作液7mL/瓶，孔雀石綠標準樣品lmL/瓶，底物液7mL/瓶，底物緩衝液7mL/瓶，終止液7mL/瓶，濃縮洗液50mL/瓶，樣品稀釋液50mL/瓶。分裝後貼標籤，註明批號和有效期，4°C保存。(9)試劑盒的組裝分別將可拆卸包被好包被抗原的微孔板1塊，酶標記孔雀石綠抗體工作液、底物液、底物緩衝液、終止液、濃縮洗液、樣品稀釋液各l瓶，孔雀石綠標準溶液6瓶，使用說明書〗份置試劑盒內指定位置。試劑盒檢驗合格後封裝，4'C保存。實施例6酶聯免疫試劑盒組分的配製實驗步驟同實施例5，不同的是採用細菌提取的鹼性磷酸酯酶為標記酶，所述底物液為對硝基磷酸鹽緩衝液，所述底物緩衝液為含有過氧化氫或過氧化脲的pH5.0磷酸-檸檬酸緩衝溶液，所述終止液為12mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液，按照實驗室常規方法配製。實施例7組建檢測孔雀石綠的酶聯免疫試劑盒，包含下述組分(1)包被孔雀石綠抗原的96孔酶標板，或根據產品規格的需要選用40孔酶標板；(2)辣根過氧化物酶標記孔雀石綠單克隆抗體，7mL/瓶；(3)孔雀石綠標準品溶液6瓶，濃度分別為0ug/L、0.1ug/L、0.3ug/L、0.9ng/L、2.7ng/L和8.liig/L，lmL/瓶;(4)底物緩衝液，7mL/瓶；(5)底物液，7mL/瓶；(6)終止液，7mL/瓶;(7)濃縮洗滌液，50niL/瓶；(8)樣品稀釋液，50mL/瓶；(9)使用說明書，l份；(10)蓋板膜，2張；(11)自封袋(含乾燥劑)，l個。實施例8待測樣品前處理(1)取剪碎魚肉樣品5g置入離心管中，加入lOmL乙酸乙酯，充分打碎均質；(2)4000rpm/min離心10min，取上清在5CTC水浴下氮氣流吹乾樣品；(3)以等量環己烷和蒸餾水混合提取渦旋l分鐘，取環己垸層，加入62.5uL1MHCU渦旋1分鐘，靜置30min;(4)加入125uL蒸餾水，8000rpm/min離心10min，棄去上層環己烷，吸取下層清液，用1NNaOH調整到p朋.08.0與稀釋液進行4倍稀釋後，取50uL進行分析。實施例9使用試劑盒的檢測方法(1)將試劑盒從冷藏環境中取出，置於室溫，即2024。C，平衡30min以上，將足夠標準和樣品所用數量的條板固定於支架，標準和樣品做兩個平行實驗，按順序編號。(2)在標準品孔加入50yL標準品，樣品孔加入50iiL待測樣品。然後每孔加入50uL酶標記物，輕拍混勻。蓋上蓋板膜，在室溫孵育20min。(3)倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打，每輪洗板拍打3次，以保證完全除去孔中的液體。用250uL蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中的液體，再重複操作3遍。(4)每孔加入100pL顯色液(將底物緩衝液與底物液等體積混合)，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，暗處室溫孵育15min。(5)加入50uL反應終止液到微孔中。混合好在波長450nm或492nm，以空氣為空白，測定各孔吸光值，必須在加入終止液後60min內讀取吸光值。檢測結果計算與分析以所獲標準樣品吸光值的平均值計算百分吸光度值，以百分吸光度值為縱坐標，孔雀石綠標準溶液濃度的半對數為橫坐標繪製標準曲線，求出直線方程。見附圖l。Y—14.756X+87.767;R2=0.9974。用同樣的方法計算樣品溶液的百分吸光度值，根據方程式求出對應樣品的孔雀石綠濃度。所述百分吸光度值的計算式為百分吸光度值(%)二(B/B。)X100其中，B為標準溶液或樣品的平均吸光值，Bo為Oug/L標準溶液的平均吸光度值。檢測結果的分析還可以利用計算機專業軟體進行計算與分析，對孔雀石綠線性檢測範圍為0.18.1iig/L，檢測限為0.1ng/L，整個檢測過程只需35min就可以完成。實施例IO試劑盒精密度與準確度試驗1、標準品溶液重複性試驗從3批按照實施例4(6)中的方法製備的酶標板中，各抽出20個微孔，測定0.9ug/L標準溶液的吸光度值(OD值)，重複20次，計算變異係數CVX，結果見表l。表1標準品溶液重複性試驗tableseeoriginaldocumentpage22結果表明試劑盒標準品檢測的批內變異係數範圍在3.74.8%之間，批間變異係數為8.7%。2、樣本重複性與準確度試驗準確度是指測得值與真值的符合程度，在ELISA測定中，準確度常以回收率表示，精密度常以變異係數來表示。在空白淡水魚肉中，將孔雀石綠添加至終濃度為1Pg/L(Pg/kg)、5Pg/L(Pg/kg)，每個濃度各10個平行，測定3批。計算平均值、添加回收率及批內與批間變異係數。結果見表2。表2樣本重複性與準確度試驗結果添加第l批第2批第3批tableseeoriginaldocumentpage23結果表明淡水魚肉樣本的添加回收率在81.0109%之間，批內變異係數在4.18.8%之間，批間變異係數在12.8].3.7%之間。實施例11保存期試驗(1)將試劑盒放置於28。C，分別取O、2、4、6、8、9、10、11和12個月的試劑盒，對孔雀石綠標準樣品(0.1ug/L)的吸光度值、50%抑制濃度、添加回收率、批內變異係數各參數進行測定。(2)將試劑盒在37i:保存的條件下放置12天，每天對孔雀石綠標準樣品(0.1ng/L)的吸光度值、50%抑制濃度、添加回收率、批內變異係數各參數進行測定。(3)將試劑盒在一2(TC冰箱保存12天，每天對孔雀石綠標準樣品(0.1iig/L)的吸光度值、50%抑制濃度、添加回收率、批內變異係數各參數進行測定。從結果可看出，經過三種條件保存試驗，孔雀石綠標準樣品(0.1Pg/L)的吸光度值下降小於5%，且OD不低於1.5;50%抑制率在0.51，0pg/L之間；添加回收率在70105%之間；批內變異係數小於10%;各項指標均符合質量要求，因此，試劑盒可以在28。C保存12個月。權利要求1、一種孔雀石綠殘留的酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於包含下列成分(1)包被了孔雀石綠抗原的酶標板；(2)酶標記孔雀石綠抗體工作液；(3)孔雀石綠標準溶液；(4)底物液；(5)底物緩衝液；(6)反應終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)樣品稀釋液。2、根據權利要求1所述的酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於所述酶標板採用96'孔或40孔酶標板，包被有能與抗孔雀石綠抗體特異結合的孔雀石綠抗原，並封閉微孔表面未吸附孔雀石綠抗原的位點；所述孔雀石綠抗原是採用重氮化法將孔雀石綠半抗原與載體蛋白進行偶聯得到。3、根據權利要求1所述酶聯免疫分析試劑盒，其特徵在於所述所述酶標記孔雀石綠抗體工作液為採用戊二酸法或過碘酸鹽氧化法將標記酶與孔雀石綠抗體進行偶聯得到；所述標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取的鹼性磷酸酯酶。4、根據權利要求3所述酶聯免疫分析試劑盒，其特徵在於所述孔雀石綠抗體為鼠單克隆抗體、兔多克隆抗體或基因工程抗體任意一種。5、根據權利要求1所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物液為含有3，3，5，5—四甲基聯苯胺或鄰苯二胺的pH5.0磷酸-檸檬酸緩衝溶液，所述底物緩衝液為含有過氧化氫或過氧化脲的pH5.0磷酸-檸檬酸緩衝溶液，所述終止液為12mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液；當標記酶為細菌提取的鹼性磷酸酯酶時，所述底物液為對硝基磷酸鹽緩衝液，所述底物緩衝液為含有過氧化氫或過氧化脲的pH5，0磷酸-檸檬酸緩衝溶液，所述終止液為12mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液。6、根據權利要求1所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述濃縮洗滌液為含0.51.5%吐溫20的磷酸鹽緩衝液，磷酸鹽緩衝液pH7.4，濃度為0.lmol/L。7、根據權利要求1所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述樣品稀釋液為含0.05%吐溫20的0.01mol/L磷酸鹽緩衝液，磷酸鹽緩衝液pH7.4。8、根據權利要求1所述的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於所述孔雀石綠標準溶液的濃度分別為8.lyg/L、2.7iig/L、0.9ug/L、0.3ug/L、0.lug/L和0ug/L。9、一種權利要求1所述的酶聯免疫檢測試劑盒的使用方法，其特徵在於包括以下步驟(1)樣品前處理；(2)使用試劑盒進行檢測；(3)結果處理與分析。10、根據權利要求9所述方法，其特徵在於步驟(2)包括以下步驟(1)將試劑盒從冷藏環境中取出，置於室溫平衡；(2)將標準品或待測樣品加入已經包被有孔雀石綠抗原的酶標板孔內，然後每孔加入酶標記物，輕拍混勻，孵育；(3)洗滌；(4)每孔加入等量的底物緩衝液與底物液，輕拍混勻，避光孵育.(5)每孔加入反應終止液，混合均勻，在波長450nm或492nm下，以空氣為空白，酶標儀測定各孔吸光值。全文摘要本發明公開了一種檢測動物源性食品中孔雀石綠殘留的酶聯免疫試劑盒，包括包被孔雀石綠抗原的酶標板，酶標記孔雀石綠抗體工作液、孔雀石綠標準溶液、底物液、底物緩衝液、反應終止液、濃縮洗滌液和樣品稀釋液。本發明還公開了應用上述試劑盒檢測孔雀石綠殘留的方法，包括進行樣品的前處理，利用試劑盒進行檢測，結果的處理與分析等步驟。本發明提供的檢測孔雀石綠的試劑盒採用直接競爭酶聯免疫吸附分析技術，靈敏度高、穩定性好，大大簡化了操作步驟和反應時間，減少了因操作複雜引起的誤差，降低了成本，非常適合大量樣品的篩查，具有重要的現實意義。文檔編號G01N33/543GK101226194SQ200810025908公開日2008年7月23日申請日期2008年1月18日優先權日2008年1月18日發明者孫遠明,楊金易,沈玉棟,宇王,弘王,肖治理,雷紅濤申請人:華南農業大學