一種無色孔雀石綠免疫原的製備方法
2023-07-25 01:25:36
專利名稱：一種無色孔雀石綠免疫原的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種無色孔雀石綠免疫原，特別是涉及一種無色孔雀石綠免疫原的製備方法。
背景技術：
無色孔雀石綠免疫原的製備通常要實施合成無色孔雀石綠免疫原過程，然而，在合成無色孔雀石綠免疫原過程中，現有的方法如重氮化法一般分兩個步驟進行偶聯合成， 所花費的時間需要70小時左右，這樣，會使得合成無色孔雀石綠免疫原過程延長，造成生產效率降低，產品成本增加，同時，後續使用成本也隨著提高，另外，其偶聯比率一般僅在 2-10左右。
發明內容
本發明的目的是要提供一種無色孔雀石綠免疫原的製備方法，它不但能有效地製得無色孔雀石綠免疫原，而且，操作簡單，生產效率高。為了達到上述的目的本發明的解決方案是本發明的一種無色孔雀石綠免疫原的製備方法操作如下，先將牛血清白蛋白、氨基無色孔雀石綠、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽以摩爾比1 :592:5216的比例一一加入到磷酸鹽緩衝液中，在室溫下反應2個小時，接著將反應後的液體裝入透析袋中，再放入500mL蒸餾水中透析48小時，每12 小時換液一次，最後收集透析袋內的液體，在-20°C中預冷凍2小時，然後在-50°C下冷凍乾燥，即製成無色孔雀石綠免疫原紫色固體粉末。所述的磷酸鹽緩衝液是pH為6. 8，含量為0. 01mol/L的磷酸鹽緩衝液。所述的透析袋是半周長為22mm，截留分子量為14000的透析袋。由於本發明首次利用了改進的碳二亞胺法，對合成的氨基無色孔雀石綠，進行了用於無色孔雀石綠免疫原的合成，免疫原是由氨基無色孔雀石綠和牛血清蛋白在室溫條件下，通過改進碳二亞胺法進行偶聯反應，用蒸餾水透析後，經過冷凍乾燥獲得的。實驗表明，該方法不僅成功地合成了可用於製備檢測無色孔雀石綠特異抗體的免疫原，同時採用了新的偶聯方法，整個製備實驗一步完成，所需時間僅為40個小時，大大節約了製備無色孔雀石綠免疫原的時間，並提高了生產效率，其效率可提高49%左右，且降低了生產成本，與此同時還採用了蒸餾水作為透析液，該方法也降低了生產成本，另外，本發明製備的免疫原的偶聯比率在25 — 37之間，因此，對提高無色孔雀石綠藥物殘留酶聯免疫檢測方法的準確度和靈敏度有了可靠的保障，並且，還有利於普及推廣應用。
具體實施例方式以下將對本發明的一種無色孔雀石綠免疫原的製備方法作進一步的詳細描述。具體步驟如下
1、合成氨基無色孔雀石綠a)稱取0.2g無色孔雀石綠溶於2mL濃硫酸，攪拌加熱維持溫度在90°C，滴加2mL濃硫酸和2mL濃硝酸混合液，反應2小時，冷卻後將反應液加入3-10mL冰水中，滴加碳酸氫鈉中和至鹼性(PH為7. 5-10)，有黃色結晶析出；
b)在獲得的黃色晶體中加入IOmL鹽酸溶液，之後加入鋅粉lg，在85°C_95°C油浴溫度下反應5小時，反應完全冷卻後加蒸餾水15mL，攪拌過濾除去固體雜質，濾液用氫氧化鈉中和至鹼性(PH為7. 5-10)後立刻出現大量沉澱，抽濾，將殘留物進行真空乾燥，得到紫色的固體即為氨基無色孔雀石綠；
2、配置磷酸鹽緩衝液
稱取9. 6g的氯化鈉、3. 58g十二水磷酸氫二鈉、0. 4g氯化鉀、0. 7g磷酸二氫鉀加入 950mL的蒸餾水，滴加鹽酸調節pH (酸鹼度)至6. 8，再加入50mL的蒸餾水，配置成IOOOmL, 濃度為0. 01mol/L的磷酸鹽緩衝液；
3、製備無色孔雀石綠免疫原
a)在15mL的離心管中依次加入牛血清白蛋白32mg(0. 48u mol)、氨基無色孔雀石綠 20mg (132u mol)、l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽480mg (2503. 8u mol), 再加入8mL的磷酸鹽緩衝液(pH為6. 8，含量為0. Olmol/L)，在室溫下反應2小時；
b)將反應好的液體裝入透析袋(半周長22nm，截留分子量14000)內，再放入裝有500mL 蒸餾水的燒杯中，透析48小時，每12小時換蒸餾水一次；
c)將透析好的液體，在_20°C中預冷凍2個小時，然後在_50°C下冷凍乾燥，製成免疫原紫色固體粉末。
權利要求
1.一種無色孔雀石綠免疫原的製備方法，其特徵在於通過下列方法製得先將牛血清白蛋白、氨基無色孔雀石綠、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽以摩爾比1 592:5216的比例一一加入到磷酸鹽緩衝液中，在室溫下反應2個小時，接著將反應後的液體裝入透析袋中，再放入500mL蒸餾水中透析48小時，每12小時換液一次，最後收集透析袋內的液體，在_20°C中預冷凍2小時，然後在-50°C下冷凍乾燥，製成無色孔雀石綠免疫原紫色固體粉末。
2.根據權利要求1所述的無色孔雀石綠免疫原的製備方法，其特徵在於所述的磷酸鹽緩衝液是PH為6. 8，含量為0. 01mol/L的磷酸鹽緩衝液。
3.根據權利要求1所述的無色孔雀石綠免疫原的製備方法，其特徵在於所述的透析袋是半周長為22mm，截留分子量為14000的透析袋。
全文摘要
一種無色孔雀石綠免疫原的製備方法。本發明的無色孔雀石綠免疫原的製備方法的特徵在於通過下列方法製得先將牛血清白蛋白、氨基無色孔雀石綠、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽以摩爾比1∶592:5216的比例一一加入到磷酸鹽緩衝液中，在室溫下反應2個小時，接著將反應後的液體裝入透析袋中，再放入500ml蒸餾水中透析48小時，每12小時換液一次，最後收集透析袋內的液體，在-20℃中預冷凍2小時，然後在-50℃下冷凍乾燥，製成無色孔雀石綠免疫原紫色固體粉末。本發明使製備過程簡化，製備無色孔雀石綠免疫原的時間縮短，生產效率提高49%左右，並且也降低了生產成本，有利於推廣應用。
文檔編號C07K14/765GK102206268SQ20111008816
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月8日 優先權日2011年4月8日
發明者姜有聲, 孫琪, 楊先樂, 胡鯤, 陳力 申請人:上海海洋大學