用於提高檢測b細胞免疫球蛋白基因重組的方法
2023-08-10 15:00:21 2
專利名稱：用於提高檢測b細胞免疫球蛋白基因重組的方法
用於提高檢測B細胞免疫球蛋白基因重組的方法本申請要求2010年3月29日提交的美國臨時專利申請號61/318，417的優先權。發明領域本發明涉及用於識別和量化B細胞免疫球蛋白基因重組的方法。更具體地，本發明涉及設計用於增加來自免疫球蛋白cDNA和/或RNA的PCR-擴增產物數量的引物的方法。
背景技術：
當考慮科學研究的「停滯地帶」時，免疫學已經成為了身體及其在健康和疾病時的狀態的研究的主要部分。科學家不斷地發現身體的天然防禦系統和疾病之間的聯繫，這曾經被認為與免疫學無關。免疫系統的細胞提供炎性應答的最顯著部分，且炎症可以與不同疾病，如心血管病、腎病、糖尿病、關節炎、和癌症有關。炎性應答必須小心地平衡,並且當該平衡得不到維持時，可以導致由免疫缺陷引起的疾病，或者在型譜另一端導致「自身免疫疾病」諸如系統性紅斑狼瘡(SLE)、風溼性關節炎(RA)和結節病。Anthony Fauci博士，Μ.D.,美國國家變態反應和傳染病學院(UnitedStatesNational Institute of Allergy and Infectious Disease, NIAID)院長，由於提出「定義處於健康和疾病的人免疫系統狀態是人免疫學研究的主要目標」(NIH新聞(NIH News),2010年 3 月 8 日,http: / / www.nih.gov, news/heal th/mar2010/niaid-Q8a.htm)而被弓 I 證。NIAID的的科學家認識到「目前用於檢查處於血液中的免疫細胞混合物中基因表達差異的方法沒有考慮即使在健康個體中存在廣泛範圍的各自細胞類型比例的變化」(Mark Davis博士，NIH新聞(NIH NewS)，2010年3月8日)。他們團隊關於該問題的方法是一種分析通過使用微陣列技術獲得的分子數據的新型數學方法——微陣列細胞特異的顯著性分析(csSAM)由B細胞提供的抗體應答在免疫系統針對攻擊的應答中產生顯著程度的多樣性。通過抗原的攻擊，B細胞轉移至B細胞濾`泡並構建生發中心(GCs)。重排的免疫球蛋白基因，本身作為顯著的多樣性來源，進一步通過恆定區的類型-轉換重組和高變區的體細胞高突變來修飾。這些區域中的突變率已經估計比自發遺傳突變的高約IO6倍。需要更靈敏的檢測B細胞多樣性的方法，以提供對處於健康和疾病的免疫系統狀態的更好的理解。發明概述本發明涉及用於提高免疫球蛋白重組區PCR擴增和增加可檢測重組分子數量的方法，所述方法包括將約3至約5個隨機產生的核苷酸添加至用於PCR擴增一個或多個免疫球蛋白可變區的至少一個引物的3』末端，5』末端，或3』和5』末端二者。附圖簡述
圖1圖示來自人患者的B細胞群的免疫球蛋白可變區的PCR擴增結果。泳道1-3圖示使用對照引物(在3』末端無隨機產生的核苷酸序列)的PCR產物的相對產量，且4-6圖示使用實驗引物(在3』末端具有隨機產生的核苷酸序列)的擴增序列的相對數量。泳道I表示來自正常個體RNA的擴增產物。泳道2來自CLL患者，且泳道3是空白，作為陰性對照。泳道4表示來自由正常個體分離的RNA的擴增產物，泳道5來自CLL患者，且泳道6是陰性對照。擴增條件相同。向引物添加3』隨機產生的核苷酸，如通過泳道1、2、4和5中條帶之間的強度差別所示，產生顯著更多的擴增產物。圖2圖示多個靶標的測序結果，所述靶標用於檢測來自不同個體的重排。檢測這些重排及其相對頻率、缺乏某些序列等可以提供關於免疫系統狀態及其在健康和疾病中作用的有價值信息。詳述本發明人已經開發了用於提高免疫球蛋白重組區PCR擴增和增加來自人和/或動物的B細胞群樣品的可檢測重組分子數量的新方法。本發明包括將約3至約5個隨機產生的核苷酸添加至用於PCR擴增一個或多個免疫球蛋白可變區的至少一個引物的3』末端，5』末端，或3』和5』末端二者。所述方法與利用在一個末端或兩個末端無隨機產生的核苷酸的引物的擴增反應相比，提供增多數量的擴增產物。在生發中心中，B細胞通過體細胞高突變來修飾重排的免疫球蛋白基因。該高突變提供另外的多樣性和抗原結合特異性。它還在免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因的V區中和附近引入突變。近期改善了引物設計，因為開發了電腦程式來協助設計更容易與這些序列結合的簡併引物。然而，為了檢測表示抗體分子重組的真實群的重組，本發明人已經發現可檢測的分子數量可以通過使用下述引物而增加，所述引物在高變區接合處結合併考慮該區中序列的高變性質。本發明提供用於擴增來自人或動物血液樣品的RNA和/或cDNA的方法。然而，樣品還可以獲自人或動物體的骨髓或其他B細胞源。「重組免疫球蛋白序列」表示體內已經發生的不同遺傳重排，其導致不同的多樣性抗體。擴增可以通過本領域中技術人員已知的多種方法進行，並且其可以通過使用商購試劑盒而簡化。用於擴增來自單個樣品的多個靶標的方法已經記述在，例如，美國專利申請
發明者韓建 申請人:韓建