一種低熱原重組人白細胞介素1受體拮抗劑(rhIL－1ra)及其高效製備方法

2023-07-14 23:36:16 3

>熱原質試驗符合《生物製品熱原質試驗規程》要求＜0.5EU/mg符合規定試驗例1重組人白細胞介素1受體拮抗劑(rhIL-1ra)活性檢測實驗1、材料細胞株A375.S2(人黑色素瘤細胞系，ATCC)，經檢測無支原體汙染後，用含10％新生小牛血清(NBS)的DMEM培養液在37℃、5％CO2、飽和溼度的條件下傳代培養於25-75cm2方瓶中；培養液A，為含10％NBS的DMEM培養液；0.25％胰蛋白酶溶液；IL-1β(比活性≥1×107U/mg，RD生產)；IL-1ra標準品(活性為1U/mg，NIBSC)。2、實驗步驟①將凍幹的標準品(10μg)用1.25ml水溶解，分裝凍存，使用前用培養液B稀10倍，使其濃度為800ng/ml。將待測品用培養液B稀釋成800ng/ml②.在96孔培養板上每孔加入100μl培養液B③.將稀釋的待測品及標準品加50μl於96孔培養板的第一孔，以1∶3稀釋，共11個濃度，每一個濃度作3個復孔。設陰性對照(加入100μlB液)和陽性對照(加入100μlA液)各三個孔。④.取對數生長期的A375.S2細胞，胰蛋白酶消化記數後，用培養液A調細胞濃度為7×104個/ml，96孔培養板中每孔加100μl。⑤.將96孔板放入37℃、5％CO2的二氧化碳孵箱中培養96個小時(即陰性對照孔的細胞死亡90％以上)，每孔用Hank’s液洗細胞一次，加50μl無血清DMEM，每孔再加入20μlMTT(5mg/ml)，繼續培養5小時。取出培養板吸出培養液，加入150μl裂解液，吹打以充分溶解還原物(formazan)。用酶聯免疫檢測儀(Model550，Bio-Rad)以實驗波長570mm，參比波長630mm測定OD值。⑥.結果計算以OD值為Y軸，以標準品待測樣品蛋白濃度為X軸，給出增殖抑制曲線，計算標準品ED50的蛋白稀釋度及待檢樣品ED50的蛋白稀釋度。按以下計算公式計算待測樣品的活性單位按如下公式計算比活性樣品比活性(mU/mg)＝待檢樣品效價(mU/ml)/蛋白質含量濃度(mg/ml)3、實驗結果用以上方法測定上述實施例製備的A、B、C三批樣品的活性及比活性，以2mg/ml的KineretTM作為對照，結果如下樣品A活性＝(10/1.25)*(3837.5/10)*(915.853/924.243)＝3042.13mU/ml比活性＝3042.13/3.07＝990.9mU/mg樣品B活性＝(10/1.25)*(3600/10)*(985.700/844.621)＝3361.05mU/ml比活性＝3361.05/2.88＝1167.0mU/mg樣品C活性＝(10/1.25)*(3737.5/10)*(778.501/792.954)＝2935.50mU/ml比活性＝2935.50/2.99＝981.8mU/mg對照品活性＝(10/1.25)*(2500/10)*(948.935/908.138)＝2089.9mU/ml比活性＝2089.9/2.0＝1044.95mU/mg本實驗表明本發明重組人白細胞介素-1受體拮抗劑具有較強的的活性。實驗例2本發明重組人白細胞介素1受體拮抗劑(rhIL-1ra)製劑藥效學試驗採用SD大鼠作為受試動物，分別用完全弗氏佐劑和雞II型膠原(CII)乳劑造成佐劑性及膠原性關節炎損傷模型，應用已通過美國FDA批准的KineretTM與本發明製備的重組人白細胞介素-1受體拮抗劑(rhIL-1ra)製劑進行比較，評價本發明rhIL-1ra對關節炎的治療作用。a、白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)製劑對大鼠佐劑性關節炎的影響本實驗研究參照國家衛生部藥政局印發的《新藥審批辦法》中附件五「新藥藥理、毒性研究的技術要求」，結合國內外相關研究資料，採用SD大鼠作為受試動物，一側足爪注射完全弗氏佐劑造成大鼠佐劑性關節炎(adjuvantarthritis，AA)模型，應用已通過美國FDA批准上市的KineretTM(anakinra)與白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)進行比較，評價了IL-1ra對大鼠佐劑性關節炎的治療作用。受試藥物IL-1ra由我公司提供。臨用藥前用無菌磷酸緩衝液配製成所需濃度。實驗動物為雄性SD大鼠，隨機分為6組，即正常對照組、模型對照組、IL-1ra三個劑量組(2.5、10、40mg/kg/次，皮下注射，每日3次)和陽性藥對照組(Kineret，40mg/kg/次，皮下注射，每日3次)。除正常對照組外，各實驗組大鼠足爪皮內注射完全弗氏佐劑(CFA，10g/L)0.1ml，致炎後第12天關節炎症出現後即開始用藥，連續7天。分別於致炎後第12天、16天、20天、24天測定大鼠足腫脹度及進行足爪評分；大鼠致炎後d28，檢測T、B淋巴細胞增殖反應及腹腔巨噬細胞產生IL-1的活性，同時對踝關節進行病理組織學觀察。試驗結果表明，IL-1ra對大鼠佐劑性關節炎(AA)有明顯的治療作用。現在小結如下(1)IL-1ra能明顯減輕AA大鼠足腫脹程度。(2)IL-1ra能明顯減少AA大鼠足爪評分分值。(3)IL-1ra能明顯降低AA大鼠B淋巴細胞增殖反應和腹腔巨噬細胞IL-1的產生、可恢復降低的T淋巴細胞增殖反應。(4)病理組織學觀察結果表明，IL-1ra可明顯減輕AA大鼠關節中炎性細胞浸潤、滑膜增生、血管翳形成、軟骨和骨的破壞。(5)在本試驗中，對受試藥IL-1ra與陽性藥Kineret的療效進行比較，結果表明，受試藥物IL-1ra對AA大鼠的治療作用與Kineret相近。b、白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)製劑對大鼠膠原性關節炎的影響本實驗研究參照國家衛生部藥政局印發的《新藥審批辦法》中附件五「新藥藥理、毒性研究的技術要求」，結合國內外相關研究資料，採用SD大鼠作為受試動物，皮內注射雞II型膠原(CII)乳劑造成大鼠膠原性關節炎(Collagen-inducedarthritis，CIA)模型，應用已通過美國FDA批准的KineretTM(anakinra)與白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)進行比較，評價了IL-1ra對大鼠膠原性關節炎的治療作用。受試藥物IL-1ra由我公司提供。臨用藥前用無菌磷酸緩衝液配製成所需濃度。實驗動物為雄性SD大鼠，隨機分為6組，即正常對照組、模型對照組、IL-1ra三個劑量組(2.5、10、40mg/kg/次，皮下注射，每日3次)和陽性藥對照組(Kineret，40mg/kg/次，皮下注射，每日3次)。除正常對照組外，各實驗組大鼠皮內多點注射雞CII乳劑1ml，第7天時，再皮內多點注射同等劑量的該乳劑激發CIA模型的產生。致炎後第10天關節炎症出現後即開始用藥，連續7天。分別於致炎後第10天、14天、18天、22天、26天測定大鼠足腫脹度及進行足爪評分；檢測大鼠遲發性變態反應；大鼠致炎後d28，檢測T、B淋巴細胞增殖反應及腹腔巨噬細胞IL-1的產生、ELISA法測定血清抗CII抗體、同時對踝關節進行病理組織學觀察。試驗結果表明，IL-1ra對大鼠膠原性關節炎(CIA)有明顯的治療作用。(1)L-1ra能明顯減輕CIA大鼠足腫脹程度。(2)IL-1ra能明顯減少CIA大鼠足爪評分分值。(3)IL-1ra能抑制CIA大鼠體重的下降。(4)IL-1ra能明顯降低CIA大鼠T、B淋巴細胞增殖反應和腹腔巨噬細胞IL-1的產生。(5)IL-1ra能明顯降低CIA大鼠遲發性變態反應及血清中抗CII抗體水平。(6)病理組織學觀察結果表明，IL-1ra可明顯減輕CIA大鼠關節中炎性細胞浸潤、滑膜增生、血管翳形成、軟骨和骨的破壞。在本實驗中，對受試藥IL-1ra與Kineret的療效進行比較，結果表明，受試藥物IL-1ra對CIA大鼠的治療作用與Kineret相近。同時，在上述動物實驗中，並沒有發現任何由熱原所引起的不良發應。為了能低成本地生產大量的rhIL-1ra蛋白，本發明提供了表達載體、宿主菌、重組質粒，以及高效表達重組人IL-1ra的工程菌和重組人IL-1ra的製備方法。在上述實例中，設計引物，利用RT-PCR技術擴增出了人hIL-1racDNA。然後插入到pBV220表達載體中，轉化E.coli(DH5α)後使人IL-1ra在E.coli(DH5α)中得到高效表達；本發明方法還明確了生產過程中純化重組人白細胞介素1受體拮抗劑(rhIL-1ra)的合適的凝膠柱種類和這些凝膠柱的最佳使用順序，同時對使用方法進行了優化，既能高效去除熱原，又能同時純化產品，具有極大的應用價值。通過以上實例表明，本發明重組人白細胞介素1受體拮抗劑(rhIL-1ra)熱原低，各批次內毒素含量均＜0.5EU/mg，熱原含量完全符合《中國藥典》三部對同類產品的要求；純度高，其HPLC純度在99％以上；活性強，效價高。由本發明重組人白細胞介素1受體拮抗劑(rhIL-1ra)添加藥學上可以接受的輔助性成分所製備的治療的製劑，在動物實驗中在表現出很好療效的同時，也沒有出現任何由內毒素等熱原物質引起的不良反應，是一種安全有效的治療類風溼性關節炎的藥物，具有很好的開發前景。以上對本發明的詳細描述並不限制本發明，本領域的技術人員可以根據本發明的思想作出各種改變及變形，比如對製備發酵工藝中的參數進行較小幅度的改變，選用與本發明所使用的凝膠柱內填料的商品名不同但種類相同且指標相同或接近的產品，調節層析步驟的流速等，只要不脫離本發明的精神，均屬於本發明所附權利要求所定義的範圍。一種低熱原重組人白細胞介素1受體拮抗劑(rhIL-1ra)及其高效製備方法.ST25SEQUENCELISTING110四川恆星生物醫藥有限公司120一種低熱原重組人白細胞介素1受體拮抗劑(rhIL-1ra)及其高效製備方法130A0600221603170PatentInversion3.2210121133212DNA213Artificial220223引物14001tttcatatgcgaccctctagagggaaaaaatcc33210221136212DNA213Artificial220223引物24002aaaggatccttattagtcctcctcctggaagtagaa362103211462212DNA213Artificial220223重組人IL-1ra基因序列4003atgcgaccctctgggagaaaatccagcaagatgcaagccttcagaatctgggatgttaac60cagaagaccttctatctgaggaacaaccaactagttgctggatacttgcaaggaccaaat120gtcaatttagaagaaaagatagatgtggtacccattgagcctcatgctctgttcttggga180atccatggagggaagatgtgcctgtcctgtgtcaagtctggtgatgagaccagactccag240ctggaggcagttaacatcactgacctgagcgagaacagaaagcaggacaagcgcttcgcc300ttcatccgctcagacagtggccccaccaccagttttgagtctgccgcctgccccggttgg360ttcctctgcacagcgatggaagctgaccagcccctcagcctcaccaatatgcctgacgaa420ggcgtcatggtcaccaaattctacttccaggaggacgagtaa46權利要求1.一種重組人白細胞介素1受體拮抗劑，其特徵在於其內毒素含量小於1Eu/mgrhIL-1ra。2.根據權利要求1所述的重組人白細胞介素1受體拮抗劑，其特徵在於其內毒素含量小於0.5Eu/mgrhIL-1ra。3.根據權利要求1或2所述的重組人白細胞介素1受體拮抗劑，其特徵在於其HPLC純度等於或大於99％。4.一種製備權利要求1～3任一項所述的重組人白細胞介素1受體拮抗劑的方法，其特徵在於它包括以下步驟a、以具有如SEQNO.1所示的核苷酸序列的引物1和具有如SEQNO.2所示的核苷酸序列的引物2，擴增重組人白細胞介素1受體拮抗劑的cDNA序列，再用平端連接的方式，構建含編碼重組人白細胞介素1受體拮抗劑的cDNA序列的重組質粒pBV220-IL-1ra；b、將構建的重組質粒轉化大腸桿菌，獲得轉化子；c、從轉化子表達重組人白細胞介素1受體拮抗劑，純化、除熱原即得產物。5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，步驟a中所述的重組質粒pBV220-IL-1ra為將IL-1racDNA序列連接於質粒pBV220中的PL啟動子後製備得到的。6.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，步驟b中所述的大腸桿菌為大腸桿菌DH5α。7.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，步驟c中所述的重組人白細胞介素1受體拮抗劑的表達條件為以TB培養基為發酵用培養基，接種量為7-13％，發酵時溶氧值控制在30-50％，pH控制在7.0，在30℃下培養至OD600達到5左右時，將溫度升至42℃誘導，4.5-5.5小時後停止發酵培養，收穫細菌。8.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，步驟c中所述的重組人自細胞介素1受體拮抗劑的純化、除熱原過程為a、將細菌菌體均勻的懸浮於BufferA中，高壓勻漿破菌，將破菌液離心後棄沉澱留上清液；b、將步驟a所得上清液上用BufferA平衡好的SP-SepharoseF.F.凝膠層析柱，用BufferE洗脫，收集目標洗脫峰溶液；c、將步驟b所得洗脫峰溶液超濾脫鹽至溶液電導小於2ms/cm，上以BufferA平衡的，串聯的DEAE-SepharoseF.F.層析柱和SP-SepharoseF.F.層析柱，樣品上完後將DEAE-SepharoseF.F.柱拆下，用BufferB洗脫SP-SepharoseF.F.層析柱並收集目標洗脫峰溶液，其中，串聯時DEAE-SepharoseF.F.層析柱在前、SP-SepharoseF.F.層析柱在後；d、將步驟c所得洗脫峰溶液上用BufferB平衡好的Q-SepharoseF.F.凝膠柱，用BufferB洗至基線後再用BufferC洗脫3-5個柱床體積，再用BufferF洗脫，收集BufferF的目標洗脫峰溶液，超濾濃縮，交換緩衝液成BufferG，即得；所述各步驟中的BufferA為5mM磷酸鹽緩衝液、pH6.0，BufferB為20mMTris.Cl溶液、pH8.0，BufferC為BufferB添加0.05MNaCl，BufferE為BufferA添加0.5MNaCl，BufferF為BufferB添加0.10MNaCl，BufferG為按重量百分比含0.8％NaCl、0.018％Na2EDTA、0.2％Na3C6H5O7的溶液、pH6.5；上述各步驟中洗脫時的流速為2～20ml/min。9.一種治療類風溼性關節炎的藥物組合物，它是由權利要求1～3任一項所述的重組人白細胞介素1受體拮抗劑(rhIL-1ra)添加藥學上可以接受的輔助性成分製備而成的製劑。10.根據權利要求9所述的藥物組合物，其特徵在於所述的製劑為注射製劑或口服製劑。全文摘要本發明提供了一種重組人白細胞介素1受體拮抗劑(rhIL－1ra)及其製備方法。本發明rhIL－1ra的內毒素含量小於1Eu/mgrhIL－1ra。本發明rhIL－1raa由以下方法製備a、擴增rhIL－1ra的cDNA序列，構建含編碼rhIL－1ra的cDNA序列的重組質粒pBV220－IL－1ra；b、將構建的重組質粒轉化大腸桿菌，獲得轉化子；c、從轉化子表達rhIL－1ra，純化、除熱原即得產物。本發明rhIL－1ra熱原低、純度高、活性強，整體品質優於目前公開的rhIL－1ra。本發明方法步驟簡便，成本低廉，熱原去除效果可靠，大大提高了產量，是一種優秀的方法，適於大規模應用。文檔編號C12N15/63GK1837237SQ20061005906公開日2006年9月27日申請日期2006年2月25日優先權日2005年2月25日發明者彭紅衛,趙斌,楊偉,張寶華,周裕誠申請人:四川恆星生物醫藥有限公司