一種藥用白芨組織培養種苗繁育方法與流程
2023-07-27 07:38:26 1
本發明涉及植物繁殖
技術領域：
，特別涉及一種藥用白芨組織培養種苗繁育方法。
背景技術：
：白芨是蘭科白芨屬的一種，也稱白及。多年生草本，高20～50釐米，葉4～5枚，基部互相套疊成莖狀，中央抽出花葶。總狀花序具數朵花；花紫色或淡紅色，直徑約5釐米，由3枚萼片、2枚花瓣和1枚特化的唇瓣組成；唇瓣3裂，上面有縱褶片；雄蕊與花柱合生而成合蕊柱，合蕊柱頂端有一個花葯，前上方有一個柱頭凹穴。地下有粗厚的根狀莖，如雞頭狀，富粘性，含白及膠質，即白及甘露聚糖，可供藥用，有止血補肺、生肌止痛之效，也可供作糊料。白芨花色豔麗，出入藥外，其也是一種很好的景觀植物，因此市場對白芨的需求十分旺盛。由於市場需求的擴大，近年來我國大部分地區的野生白芨遭到過度採挖，導致其野生自然資源急劇減少，瀕臨滅絕，被國家列為重點保護的野生藥用植物之一。為保護白芨野生資源，人工繁育和栽培白芨勢在必行。目前，公告號為cn106416972a的中國專利公開了一種快速培養白芨種苗的方法，它包括將白芨的種子經萌發培養、原球莖分化培養、鱗莖誘導培養和馴化後，得到白芨幼苗的方法。這種快速培養白芨種苗的方法雖然整齊性較好，但原球莖退化快、變異比例高，種苗弱小，移栽成活率低,無法滿足大規模種植需求。技術實現要素：本發明的目的是提供一種藥用白芨組織培養種苗繁育方法，其具有繁殖速度快，質量高、適合規模化種苗繁育等優點。本發明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：一種藥用白芨組織培養種苗繁育方法，包括以下步驟：s1：外植體選取，選擇無菌裸胚萌發並生根的組培苗為外植體，保持外植體處於無菌狀態；s2：增殖培養，將無菌狀態外植體的葉片和根系切除部分或全部，接種於固體增殖培養基中，進入暗培養階段培養2～7天，然後進入光照培養階段增殖培養8～16周，將增殖率控制在3倍，增殖獲得團芽；s3：壯苗培養，每12周，將經過增殖階段培養的團芽進行分割成單芽，並切除部分或全部葉片，轉接到預製好的壯苗培養基中，暗培養2～7天，然後光照培養2～4周；s5：生根誘導，優選壯苗培養得到的高度為2cm以上的無根組培苗，從壯苗培養基中取出並接種於生根培養基中，暗培養2～7天，光照培養4～8周，至植株具有有效健壯根1～3條，完成生根。通過採用上述技術方案，由於白芨的種子非常小，而且是沒有胚乳的裸胚，因此在自然狀況下很難萌發和生長，實生苗的栽培比較困難，常用的方法主要是靠根狀莖分株繁殖，而分株繁殖的繁殖係數低，繁殖速度慢，無法滿足大規模的種植需求。而本方法是將外植體的根系、葉片切除後，在高濃度細胞分裂素作用下，促使休眠腋芽萌發並不斷誘導出叢生團芽，然後將叢生團芽分割成單個芽，轉接入壯苗培養基進行復壯培養，再轉接入生根培養基中進行生根誘導，能夠大大提高繁育培養的效率，降低繁殖周期，增加繁育速度，減少耗種量，以滿足大規模種植的需要，使白芨能夠工廠化和規模化培育。由於白芨種子是沒有胚乳、不具種皮的裸胚，常規播種很容易使種子散失生命力，而通過無菌播種，誘導種子無菌萌發，並以此為外植體進行組織培養快速擴繁，以使出苗率大大提高，且通過本方法能夠促使萌芽快速生長出苗，出苗速度快並且壯大，保證植株擁有較高的存活率。進一步設置：所述s2中培養溫度為20～30℃，暗培養時間優選為7天，光照培養時間優選為6周，光照強度為1500～3000勒克斯，優選為2000勒克斯，光周期為12～20/8h，優選16/8h。通過採用上述技術方案，暗培養的作用是使植株進行呼吸作用以誘導愈傷組織活動，而光照培養的作用是進行光合作用以誘導植株分化，通過控制光照培養期間的光照輕度和光照周期，能夠得到較為良好的團芽培育效果，使團芽上分出單芽的數量儘可能增加，進一步提升白芨繁育的效率。進一步設置，所述固體增殖培養基按以下組分和配比調配而成：花寶一號1～2.5g/l20-20-20速效平衡肥1～2.5g/l6-ba1.0～3.5mg/l椰子汁50～100ml/l蔗糖20～30g/l瓊脂5.0～7.0g/lph值為5.50～6.00，優選為5.90。該配方能夠保障腋芽增殖人為可控，增殖倍率為3～4倍，且芽體健壯。進一步設置：所述s3中暗培養時間優選為7天，光照培養時間優選為3周，光照強度2000～3000勒克斯，優選為2000勒克斯，光周期12～20/8h，優選16/8h，環境溫度為10～30℃，優選為28℃。進一步設置，所述壯苗培養基按以下組分和配比調配而成：1/2ms2.35g/l蔗糖20～30/l瓊脂5.0～7.0g/l活性炭0.5～1.0g/lph值為5.50～6.00，優選5.90。通過採用上述技術方案，該配方能夠保障單個芽生長健壯，並且生長高度達到5cm，獲得健壯的無根組培苗，便於後續轉瓶生根誘導。進一步設置：所述s4中暗培養時間優選為7天，光照培養時間優選為8周，光照強度1000～3000勒克斯，優選為2000勒克斯，光周期10～30/8h，優選16/8h，環境溫度為10～30℃，優選為25℃。通過採用上述技術方案，同樣的，在組培苗生長時，夠使每個植株具有有效健壯根1～3條，根長20～40mm，根粗1～2mm，苗高4～6cm，獲得生根組培苗，其生根率達100％。進一步設置，所述生根培養基按以下組分和配比調配而成：ms4.7g/l生長素naa1～3.0mg/l活性炭0.5～1.0g/l蔗糖15～30g/l瓊脂5.0～7.0g/lph值為5.50～6.00，優選5.90。通過採用上述技術方案，該配方和操作方式能夠保障種苗充分生根。作為優選，所述s2和s4中，植體和團芽上的根系與葉片優選為全部切除。通過採用上述技術方案，將植體和團芽上的根系與葉片全部切除可以避免植株和單芽在培育過程中由於根系和葉片的存在直接進行生根發育，同時避免根系和葉片吸收養分較多而影響培育的效果。綜上所述，本發明具有以下有益效果：能夠克服藥用白芨種子萌發率低，種苗培育難；繁殖速度慢等瓶頸；能夠快速、優質、高效的進行種苗繁育，以滿足大規模種植的需要，使白芨能夠工廠化和規模化培育。具體實施方式實施例1：一種藥用白芨組織培養種苗繁育方法，包括如下培養步驟：s1：外植體選取，選擇無菌裸胚萌發並生根的組培苗為外植體，保持外植體處於無菌狀態；s2：增殖培養，將無菌狀態外植體的葉片和根系切除部分或全部，接種於固體增殖培養基中，進入暗培養階段培養2天，然後進入光照培養階段增殖培養8周，將增殖率控制在3倍，增殖獲得團芽；s3：壯苗培養，每12周，將經過增殖階段培養的團芽進行分割成單芽，並切除部分或全部葉片，轉接到預製好的壯苗培養基中，暗培養2天，然後光照培養2周；s4：生根誘導，優選壯苗培養得到的高度為2cm以上的無根組培苗，從壯苗培養基中取出並接種於生根培養基中，暗培養2天，光照培養4周，至植株具有有效健壯根1～3條，完成生根。固體增殖培養基按以下組分和配比調配而成：花寶一號1.5g/l20-20-20速效平衡肥1.5g/l6-ba3.5mg/l椰子汁100ml/l蔗糖30g/l瓊脂6.0g/lph值為5.90。所述花寶一號，源於市售進口分裝花寶公司的通用肥料，花寶1號的n:p:k比例為7:6:19；所述20-20-20平衡肥，來自美國peters公司通用水溶肥，中文名為花多多1號；所述椰子汁為來源於市售泰國進口5kg/箱食用純椰子汁，並以巴氏滅菌法滅菌，常溫儲藏。壯苗培養基按以下組分和配比調配而成：1/2ms2.35g/l蔗糖30/l瓊脂6g/l活性炭0.5g/lph值為5.90。生根培養基按以下組分和配比調配而成：ms4.7g/l生長素naa3.0mg/l活性炭1.0g/l蔗糖15g/l瓊脂6.0g/lph值為5.90。實施例2：一種藥用白芨組織培養種苗繁育方法，與實施例1的不同之處在於，s2：增殖培養，將無菌狀態外植體的葉片和根系切除部分或全部，接種於固體增殖培養基中，將溫度維持在25℃，進入暗培養階段培養2天，然後進入光照培養階段增殖培養8周，光照強度控制在1500lux，光周期為12/8h，並將增殖率控制在3倍，增殖獲得團芽；s3：壯苗培養，每12周，將經過增殖階段培養的團芽進行分割成單芽，並切除部分或全部葉片，並將團芽轉移到壯苗培養基中，將溫度維持在28℃，暗培養2天，光照培養8周，光照強度控制在2000lux，光周期為12/8h，取生長健壯的單芽作為壯苗培養的組培苗；s4：生根誘導，優選壯苗培養得到的高度為2cm以上的組培苗，從壯苗培養基中取出並接種於生根培養基中，將溫度維持在25℃，暗培養2天，光照培養8周，光照強度控制在1000lux，光周期為12/8h，至植株具有有效健壯根1～3條，完成生根。實施例3：一種藥用白芨組織培養種苗繁育方法，與實施例1或2的不同之處在於，s2：增殖培養，將無菌狀態外植體的葉片和根系切除部分或全部，接種於固體增殖培養基中，將溫度維持在25℃，進入暗培養階段培養7天，然後進入光照培養階段增殖培養16周，光照強度控制在3000lux，光周期為20/8h，並將增殖率控制在3倍，增殖獲得團芽；s4：壯苗培養，重複s3，將切割後的團芽切除部分或全部葉片，並將團芽轉移到壯苗培養基中，將溫度維持在28℃，暗培養7天，光照培養16周，光照強度控制在3000lux，光周期為20/8h，取生長健壯的單芽作為壯苗培養的組培苗；s5：生根誘導，優選壯苗培養得到的高度為2cm以上的組培苗，從壯苗培養基中取出並接種於生根培養基中，將溫度維持在25℃，暗培養7天，光照培養16周，光照強度控制在3000lux，光周期為20/8h，至植株具有有效健壯根1～3條，完成生根。實施例4：一種藥用白芨組織培養種苗繁育方法，與實施例1的不同之處在於，固體增殖培養基按以下組分和配比調配而成：花寶一號1g/l20-20-20速效平衡肥1g/l6-ba1mg/l椰子汁50ml/l蔗糖20g/l瓊脂5.0g/lph值為5.90。壯苗培養基按以下組分和配比調配而成：1/2ms2.35g/l蔗糖20/l瓊脂5.0g/l活性炭0.5g/lph值為5.90。生根培養基按以下組分和配比調配而成：ms4.7g/l生長素naa1.0mg/l活性炭0.5g/l蔗糖15g/l瓊脂5.0g/lph值為5.90。實施例5：一種藥用白芨組織培養種苗繁育方法，與實施例1或4的不同之處在於，固體增殖培養基按以下組分和配比調配而成：花寶一號2.5g/l20-20-20速效平衡肥2.5g/l6-ba3.5mg/l椰子汁100ml/l蔗糖30g/l瓊脂7.0g/lph值為5.90。壯苗培養基按以下組分和配比調配而成：1/2ms2.35g/l蔗糖30/l瓊脂7.0g/l活性炭1.0g/lph值為5.90。生根培養基按以下組分和配比調配而成：ms4.7g/l生長素naa3.0mg/l活性炭1.0g/l蔗糖30g/l瓊脂7.0g/lph值為5.90。實施例6：一種藥用白芨組織培養種苗繁育方法，與實施例1的不同之處在於，培育全程的ph值為5.50。實施例7：一種藥用白芨組織培養種苗繁育方法，與實施例1或5的不同之處在於，培育全程的ph值為6.00。按上述實施例1至實施例7將若干外植體進行培育，每個實施例進行100組培養實驗，將獲得的生根培養組培苗消毒後進行觀測，並統計平均結果進行對比，其對比結果如下表：編號/項目有效根數/根根長/cm根粗/mm苗高cm生根率實施例1340.002.056.00100％實施例2120.551.104.2593％實施例3335.952.004.9096％實施例4222.601.354.3094％實施例5338.801.805.6096％實施例6336.851.504.7097％實施例7335.751.554.5095％由上表可以看出，實施例1為最優選擇，獲得的生根培養組培苗生根率100％，而通過其他實施例培養的生根培養組培苗生根率最低為93％，可以看出使用這種方法培育的每個植株具有有效健壯根1～3條，根長20～40mm，根粗1～2mm，苗高4～6cm，適用於白芨的大規模、工廠化培育和生產。上述的實施例僅僅是對本發明的解釋，其並不是對本發明的限制，本領域技術人員在閱讀完本說明書後可以根據需要對本實施例做出沒有創造性貢獻的修改，但只要在本發明的權利要求範圍內都受到專利法的保護。當前第1頁12