一種治療豬呼吸道綜合症的卵黃抗體注射液的製備方法
2023-08-02 11:14:51
專利名稱：一種治療豬呼吸道綜合症的卵黃抗體注射液的製備方法
技術領域：
本發明屬於獸醫生物製品技術領域，具體涉及一種治療豬呼吸道疾病的卵黃抗體的製備方法。
背景技術：
豬呼吸道疾病症候群(PRDC)以生長速度降低、飼料利用率降低、食慾減退、咳嗽、呼吸困難為特徵的疾病，雖然總體死亡率不高，但可嚴重影響豬場的經濟效益。臨床上引起豬呼吸道綜合症的主要病原有豬肺炎支原體、繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)、2型圓環病毒(PCV-2)和豬流感病毒，以及繼發感染的其它細菌性病原，如巴氏桿菌、鏈球菌和胸膜肺炎放線桿菌等病原。斷奶後各個階段的豬均可發病，即從斷奶後2周開始，一直到育肥期都可能發生呼吸道疾病綜合症。 PRRSV是一種免疫抑制性病毒，感染後可以產生病毒血症，除引起繁殖障礙外，尚可以引起全身淋巴系統，特別是肺臟巨噬細胞的破壞，導致嚴重的免疫抑制，從而促進了包括肺炎支原體、鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌在內的等多種病原體感染。最近幾年的PCV-2與PRRSV也有顯著的協同作用。肺炎支原體一方面可以破壞呼吸道的局部清除病原體的能力，使得細菌性病原體嚴重繼發感染；另一方面，通過研究發現，肺炎支原體可以調製肺臟局部的免疫應答，使肺泡巨噬細胞的的功能發生改變，從而促進了 PRRSV的感染，延長了 PRRSV感染的時間，加重了 PRRSV造成的損失。最近的研究表明，肺炎支原體還可以促進PCV-2的感染。美國學者研究發現，在呼吸道疾病綜合症(PRDC)的臨床病例中，經常發現肺炎支原體與PCV-2混合感染，而不一定有PRRSV或流感病毒的存在。PCV-2的抗原經常發現於有肺炎支原體感染誘導增生的支氣管周圍淋巴組織區域。PCV-2/肺炎支原體的混合感染模型本身表明，PCV-2或肺炎支原體單獨感染只能引起輕微的一過性呼吸道疾病和病變，但如果二者混合感染，可導致嚴重的與PRDC和PMWS —致的呼吸道疾病症狀和病變。因為PRDC的發生既有感染的因素，又有營養、飼養管理以及豬舍環境的因素，因此豬場通常採用綜合性措施加以控制，如疫苗免疫，藥物預防以及加強飼養管理等。通過綜合性的預防措施雖然可以起到一定的效果，但是由於PRRSV、PCV2等疾病的免疫抑制作用，通常在帶毒豬場免疫效果並不理想，並且PRRSV對不同來源的毒株的保護力較低，在帶毒豬場免疫PRRSV可能導致PRRSV的爆發，給豬場造成巨大的損失。肺炎支原體免疫可以減輕PRRSV的感染，預防PRDC ;但PRRSV感染又可幹擾肺炎支原體的免疫。如果在肺炎支原體免疫前感染了 PRRSV或PCV2，則肺炎支原體的免疫效果明顯降低。另外由於PRDC的發生是病毒/細菌以及支原體混合感染的結果，通常可以使用廣譜抗生素對細菌性病原進行清除，如使用金黴素、阿莫西林和氟苯尼考等抗生素，這些藥物通常可以控制大多數呼吸道細菌性病原體的感染。但抗生素的大量運用一方面將導致更多耐藥菌株的出現，增加疾病防控成本，另一方面也給食品安全帶來了隱患。目前，卵黃抗體已經廣泛運用於雞、鴨、鵝、犢牛、仔豬和羔羊等動物疾病的緊急治療和預防中，如雞傳染性法氏囊、雞新城疫、雞白痢、鴨病毒性肝炎、小鵝瘟、豬輪狀病毒、犬瘟熱、犬細小病毒病、羔羊輪狀病毒腹瀉、仔豬輪狀病毒腹瀉等。卵黃抗體是一種高產、優質的多克隆抗體，製備簡單，容易提取，可以高效特異的對病毒性/細菌性疾病進行治療；而且雞大規模工業化飼養成本低，經濟方便。同時使用卵黃抗體進行疾病治療可以減少抗生素的使用，減少耐藥株的出現，從而降低疫病控制成本。因此，卵黃抗體在生物製品的開發和疾病的防治方面具有廣闊的前景。且迄今為止，運用卵黃抗體治療豬呼吸道綜合症的研究尚未有報到。
發明內容
本發明的目的是提供一種治療豬呼吸綜合症的卵黃抗體注射液的製備方法，用於防治豬呼吸道綜合症，克服已有技術中的缺點，在降低防疫成本和耐藥性菌株產生的前提下，有效的提高動物的生產性能和疫病防治效果，且不會對人產生食源性汙染和藥物殘留。本發明的目的是通過以下技術方案來實現·一種治療豬呼吸綜合症的卵黃抗體注射液的製備方法，包括以下步驟I)分離當前流行的PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體，分別用MARC-145細胞培養PRRSV,用PK15細胞培養PCV-2和支原體培養基培養豬肺炎支原體，測定病毒和支原體滴度後製備成三聯滅活疫苗。製備的疫苗中PRRSV的TCID5tl不低於108/ml，PCV-2的TCID5tl不低於10%1，豬肺炎支原體數量不低於IOltVml ；2)利用製備的PRRSV/PCV2/豬肺炎支原體三聯滅活疫苗免疫非免疫產蛋母雞，免疫程序如下與產蛋前30天首次免疫,免疫劑量為2ml/羽，首次免疫後2、4分別進行兩次加強免疫，免疫劑量為3ml/羽。此後每隔2月全群免疫一次，免疫劑量為2ml/羽，以誘導母雞持續性的產生抗PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體的抗體；3)第三次免疫後14天收集雞蛋，運用75%乙醇消毒蛋殼，在無菌條件下收集卵黃，運用等量磷酸鹽緩衝液(O. IM PBS,PH7. 2)後置組織勻漿器中，5000轉/分勻漿I分鐘，加入乳酸至PH為4. 0，2 8°C攪拌過夜，置-80°C冷凍後解凍，並重複冷凍一次，然後8000轉/分離心10分鐘，收集上清，按照I : I的比例加入飽和硫酸銨，2 8°C攪拌2消失，後2 8°C靜置過夜，8000轉/分離心10分鐘收集沉澱，加入O. IM PBS溶解後除去硫酸銨；4)運用微量中和實驗測定PRRSV、PCV_2的中和抗體效價，運用ELISA測定豬肺炎支原體抗體效價；5)將效價測定好的卵黃抗體進行無菌檢驗，合格後無菌分裝，使PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體抗體效價不低於I : 64。本發明的有益效果為本發明中製備的卵黃抗體注射液為免疫球蛋白製劑，能夠特異性的中和PRRSV、PCV2，同時對豬肺炎支原體亦具有作用，可用於臨床上由PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體混合感染導致的豬呼吸道綜合症；使用本發明中製備的注射液不僅可以治癒易感染上述病原的豬，同時對同群未感染上述病原的豬使用可以使其獲得被動免疫；臨床實驗表明，使用本發明製備的產品後可以顯著提高豬群生產性能；本發明製備成本低，見效快，本製品無毒副作用，使用後無藥物殘留，生產使用過程中對人畜無危害，同時使用本發明中製備的產品不會導致耐藥菌毒株的出現，對食品安全無潛在的危害，適宜大規模推廣。
具體實施例方式實施例I :PRRSV流行毒株的分離鑑定以及病毒TCID5tl測定I、PRRSV流行毒株的分離鑑定I)採集疑似PRRSV發病豬血清，接種MARC-145細胞，37°C，5% C02培養，每天觀察細胞病變情況，如培養至96小時後無細胞病變出現則將細胞培養物置_40°C反覆凍融三次，12000轉/分離心10分鐘，取上清接種MARC-145細胞繼續傳代。以此類推連續進行傳代。該分離毒株傳代至第2代時在接種72小時 後出現細胞病變。2)根據GENBANK中登錄的PRRSV的序列(AY150564)設計一對特異性引物P1、P2。其中 Pl CCGACTGCTAGGGCTTCT,P2 :TATCTGCCACCCAACACG 擴增片段大小為 363bp。將出現細胞病變的病毒液上清提取RNA，運用RT-PCR進行進行PCR鑑定。如擴增出特異性的片段則判定為PRRSV陽性。2、PRRSV分離毒株的TCID5tl測定將生長良好的MARC-145細胞運用胰酶消化後按照I : 4的比例傳代到96孔板中，每孔O. Iml，然後置37°C，5% CO2培養。96孔板中細胞長滿單層後，將培養液吸出，加入病毒稀釋液，每個梯度8孔，每孔O. Iml0病毒液稀釋按照10倍倍比稀釋，選取IO1 IO9等9個稀釋度進行病毒接種。加入病毒液後置37°C，5% CO2吸附2小時，然後去除病毒液，加入細胞維持液繼續培養。培養4天後觀察並記錄細胞病變孔數,運用Reed-Muench氏法計算TCID50。實施例2滅活疫苗的製備及免疫I、菌毒滅活分別將測定好菌毒滴度的菌毒液混合，混合後製備的疫苗中PRRSV的TCID5tl不低於108/ml，PCV-2的TCID5tl不低於106/ml，豬肺炎支原體數量不低於IOltVmL混合後加入
O.2%的甲醛37°C滅活24小時。滅活檢驗合格後備用。2、滅活疫苗製備油相製備由注射用白油94體積份，加司本_80°C 6體積份，混合後，然後加硬脂酸鋁(每100毫升混合液加入2克硬脂酸鋁)，逐漸攪拌至透明為止，高壓滅菌備用。水相製備取滅菌吐溫-80°C 4體積份，加入滅活病毒液96體積份，充分振搖，使吐溫-80°C完全溶解。乳化取油相I體積份放於乳化缸內，開動電機慢速轉動攪拌，同時緩慢加入水相I體積份，加完後再以10000r/min攪拌2 5分鐘，在終止攪拌前加入I %硫柳汞水溶液，使其終濃度為O. 01%，得到製備卵黃抗體用滅活疫苗。3、疫苗免疫非免疫母雞產蛋前30天首次免疫,免疫劑量為2ml/羽，首次免疫後2、4分別進行兩次加強免疫，免疫劑量為3ml/羽。此後每隔2月全群免疫一次，免疫劑量為2ml/羽，以誘導母雞持續性的產生抗PRRSV，PCV-2和豬肺炎支原體的抗體。實施例3卵黃抗體的製備和效價測定I、卵黃抗體的製備第三次免疫後14天收集雞蛋，運用75%乙醇消毒蛋殼，在無菌條件下收集卵黃，運用等量磷酸鹽緩衝液(O. IM PBS, PH7. 2)後置組織勻漿器中，5000轉/分勻漿I分鐘，力口入乳酸至PH為4. O, 2 8°C攪拌過夜，置-80°C冷凍後解凍，並重複冷凍一次，然後8000轉/分離心10分鐘，收集上清，按照I : I的比例加入飽和硫酸銨,2 8°C攪拌2消失，後2 8°C靜置過夜，8000轉/分離心10分鐘收集沉澱，加入O. IM PBS溶解後除去硫酸銨。2、PRRSV抗體的效價測定I)細胞製備取生長良好的MARK-145細胞，運用胰酶消化後按照I : 4的比例傳代至96孔板中，每孔O. 1ml，加入至96孔板後輕微前後左右搖晃，混勻細胞使其能夠均勻貼壁。2)體外中和實驗將PRRSV病毒液進行稀釋，稀釋至2000TCID5Q/ml。取製備的卵黃抗體進行2倍倍比稀釋，取21 21°等10個稀釋度。每個稀釋度取O. 4ml卵黃抗體稀釋液加入等量的稀釋病毒液，37°C水浴I小時使卵黃抗體與PRRSV病毒進行中和反應。
3)細胞接種以及中和效價測定中和反應完畢後，將96孔板中細胞培養液去除，力口入中和反應後的混合液，每孔O. lml，37°C吸附I小時，然後去除吸附混合液，加入細胞維持液繼續培養。培養4天後觀察細胞病變孔數並記錄,然後按照Reed-Muench氏法計算中和抗體效價。3、將效價測定好的卵黃抗體進行無菌檢驗，合格後無菌分裝，使PRRSV，PCV-2和豬肺炎支原體抗體效價不低於I : 64。實施例42010年11月河北某豬場40日齡斷奶仔豬982頭，出現呼吸道症狀，主要表現為食慾減退、咳嗽、呼吸困難，喘氣，呈腹氏呼吸，喜堆臥在一起，生長緩慢，消瘦，死亡率升高。少數豬出現拉稀，皮膚發紅等症狀，且該豬場常規檢測發現有PRRSV和PCV-2的感染。此次出現呼吸道症狀後使用本發明製備的卵黃抗體進行治療(卵黃抗體治療組493頭豬)，同時設計對照組(395頭)。對照組在飲水中加入複合維生素和黃芪多糖粉劑，同時在飼料中加入枝原淨lOOppm、金黴素300ppm、阿莫西林400ppm進行飼料投藥。對照組和卵黃抗體治療組均加強飼養管理和消毒。經上述處理後兩組豬群效果均有好轉，呼吸症狀逐漸消失，動物食慾逐漸增加。至育肥期時，卵黃抗體組淘汰率為I. 8%，對照組淘汰率為2. 6%，卵黃抗體治療組效果優於對照組。本實驗結果表明，本發明製備的卵黃抗體具有較好的療效，能夠提高仔豬存活率。
權利要求
1.一種治療豬呼吸綜合症的卵黃抗體注射液的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟 1)分離當前流行的PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體，分別用MARC-145細胞培養PRRSV，用PK15細胞培養PCV-2和支原體培養基培養豬肺炎支原體，測定病毒和支原體滴度後製備成三聯滅活疫苗； 2)利用製備的PRRSV/PCV2/豬肺炎支原體三聯滅活疫苗免疫非免疫產蛋母雞； 3)在無菌條件下收集卵黃，運用等量的PH7.2的O. IM PBS後置組織勻漿器中，5000轉/分勻漿I分鐘，加入乳酸至PH為4. 0，2 8°C攪拌過夜，置_80°C冷凍後解凍，並重複冷凍一次，然後8000轉/分離心10分鐘，收集上清，按照I : I的比例加入飽和硫酸銨，2 8°C攪拌2消失，後2 8°C靜置過夜，8000轉/分離心10分鐘收集沉澱，加入O. IM PBS溶解後除去硫酸銨； 4)運用微量中和實驗測定PRRSV、PCV-2的中和抗體效價，運用ELISA測定豬肺炎支原體抗體效價； 5)將效價測定好的卵黃抗體進行無菌檢驗，合格後無菌分裝，使PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體抗體效價不低於I : 64。
2.根據權利要求I所述的治療豬呼吸綜合症的卵黃抗體注射液的製備方法，其特徵在於，步驟I)中所述製備的疫苗中PRRSV的TCID50不低於108/ml, PCV-2的TCID50不低於106/ml，豬肺炎支原體數量不低於IOltVmL
3.根據權利要求I或2所述的治療豬呼吸綜合症的卵黃抗體注射液的製備方法，其特徵在於，步驟2)中的所述免疫程序如下與產蛋前30天首次免疫，免疫劑量為2ml/羽，首次免疫後2、4分別進行兩次加強免疫，免疫劑量為3ml/羽，此後每隔2月全群免疫一次，免疫劑量為2ml/羽，以誘導母雞持續性的產生抗PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體的抗體。
4.根據權利要求3所述的治療豬呼吸綜合症的卵黃抗體注射液的製備方法，其特徵在於，步驟3)中在第三次免疫後14天收集雞蛋，運用75%乙醇消毒蛋殼，在無菌條件下收集卵黃。
全文摘要
本發明涉及一種治療豬呼吸綜合症的卵黃抗體注射液的製備方法，包括以下步驟1)分離當前流行的PRRSV、PCV-2和豬肺炎支原體，分別用MARC-145細胞培養PRRSV，用PK15細胞培養PCV-2和支原體培養基培養豬肺炎支原體，測定病毒和支原體滴度後製備成三聯滅活疫苗；2)利用製備的PRRSV/PCV2/豬肺炎支原體三聯滅活疫苗免疫非免疫產蛋母雞；3)在無菌條件下收集卵黃；4)運用微量中和實驗測定PRRSV、PCV-2的中和抗體效價，運用ELISA測定豬肺炎支原體抗體效價；5)將效價測定好的卵黃抗體進行無菌檢驗，合格後無菌分裝。本發明的有益效果卵黃抗體注射液能有針對性的對PRRSV、PCV2和豬肺炎支原體單獨感染或混合感染病豬進行有效的治療。
文檔編號A61P31/04GK102908619SQ20111022325
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月4日 優先權日2011年8月4日
發明者李帥偉, 龐程 申請人:廣州格拉姆生物科技有限公司