酶法檢測脂肪酶試劑盒及其製備方法
2023-07-24 10:42:26
專利名稱：酶法檢測脂肪酶試劑盒及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生物試劑，具體涉及一種檢測試劑盒，尤其涉及一種酶法檢測脂肪酶試劑盒及其製備方法。
背景技術：
脂肪酶(Lipase EC3.1.1.3.，LPS，甘油酯水解酶)是一類水解油酯的酶類。月旨肪酶的水解底物一般是天然油脂，其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相連接的酯鍵。它不同於其它水解酶，脂肪酶催化作用系統是一種非均相體系，水溶性的酶催化作用發生在水不溶性底物和水的界面上，這種界面上的催化作用機制不甚清楚，不能簡單用MichaelidMenten學說解釋酶與底物間的反應機制。有人提出了脂肪酶在油-水界面上定位的假設，提出了「超底物」的模型，該模型能解釋脂肪酶的一些行為，但還需要進一步的實驗證明和修正。此外，脂肪酶兼具有逆向催化甘油和游離脂肪酸合成甘油脂活性。脂肪酶在臨床的意義:正常人血液LPS含量極少，但在急性胰腺炎時，2 12h血液LPS顯著升高，24h至峰值，可達正常值上限的10倍，甚至50倍，至48 72h可能恢復正常，但隨後又可持續升高8 15天。由於血液LPS在急性胰腺炎時活性升高的時間早，上升的幅度的大，持續的時間長，故其診斷價值優於澱粉酶。臨床觀察發現，凡血液AMY升高的病例，其LPS均升高；而LPS升高者AMY不一定升高，約有2/3AMY正常的胰腺炎病人，其LPS正常；非胰腺炎的急腹症有血液AMY升高而LPS不升高。酗酒、乙醇性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、肝膽疾患等血液LPS可有不同程度的升高。迄今測定LPS的方法可分為3類:①測定產物(游離脂肪酸)的增加(如滴定法、比色法、分光光度法、螢光法和PH電極法等)；②測定底物的減少量(如比濁法、擴散法等)；③測定LPS的實際質量(雙抗體夾心免疫分析法、乳膠凝集法)。目前在國內大多實驗室主要以滴定法、比濁法和分光光度法為主。分光光度法目前有兩類比較常用:①酶偶聯顯色比色法，多用1，2_甘油二酯為底物，在LPS和單酸甘油酯脂肪酶的催化下，水解生成甘油和脂肪酸，甘油通過甘油激酶作用生成3-磷酸甘油，再通過甘油磷酸氧化酶/過氧化物酶體系和4-AAP色素原體系產生紫紅色。於550nm波長連續監測吸光度的變化即可計算LPS 活性。此類方法特異性高，通過雙試劑也基本可解決內源性甘油的幹擾問題。②l，2-o-二月桂-外消旋-甘油-3-戊酸-(6-甲基試滷靈)酯設計的連續監測法。該底物在鹼性環境中，在LPS和輔脂肪酶作用下，水解生成1，2-0_ 二月桂基甘油和戊二酸-6』-甲基試滷靈。後者不穩定，可自發分解生成戊二酸和甲基試滷靈。甲基試滷靈在581nm波長處有吸收峰，連續監測其吸光度變化可定量測定LPS活性。此法具有簡便、快速、靈敏、穩定和抗幹擾能力強等特點。但是酶偶聯顯色法，工具酶的價格昂貴，而且酶來源少且不穩定，很少有廠家用這種方法。底物水解法，底物極不穩定，試劑的本底升高的極快，造成試劑要每天定標。浪費試劑也浪費校準品。而且會造成結果的不準確。因此亟待尋求更好的檢測方法
發明內容
本發明所要解決的技術問題在於克服上述不足之處，研究設計穩定脂肪酶的人工合成底物，提高試劑穩定性，用於檢測脂肪酶的試劑。本發明提供了一種酶法檢測脂肪酶試劑盒，該試劑盒由下列試劑I和試劑2，按I份:I份的比例組成:試劑1: (2L)(試劑體積)
緩衝液10—20 O mmol /L
脫氧膽酸鈉0.01-20 ml/L
輔脂肪酶0.l-2mg/L
氯化 |丐5-20mmol/L
疊氮鈉0.5-2g/L
去離子水加至2L；試劑2: (IL)(試劑體積)
酒石酸10-200 mmol/L 牛黃脫氧膽酸鈉 0.l-10mmol/L 甘露醇10-200 mmol/L proclin300 (生物防腐劑) 0.01-0.5ml/L
疏基乙酸10-200 mmol/L
6-甲基試滷靈0.1-0.5 mmol/L去離子水加至總體積為1L。所述試劑I緩衝液選自TRIS (三輕甲基氨基甲燒tris (hydroxymethyl)aminomethane)、MOPS (3- (N-嗎啉)丙橫酸 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid)、BICINE (N, N-雙(2-羥乙基甘氨酸)或HEPES (4-羥乙基哌嗪乙磺酸4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)。本發明檢測脂肪酶試劑盒，在使用時，試劑I加檢測樣本後再加入試劑2，即可進行檢測。本發明的另一目的是提供了脂肪酶試劑盒的製備方法:該方法包括下列步驟:(一)製備試劑I: (2L)(試劑體積)(I)先向容器內加入為總量80%的去離子水；(2)依次加入緩衝液、脫氧膽酸鈉、氯化鈣、疊氮鈉；(3)加入輔脂肪酶；(4)最後加入剩餘量的去離子水至總體積為2L混合均勻，即得；( 二 )製備試劑2: (IL)(試劑體積)
向容器內依次加入牛黃脫氧膽酸鈉、甘露醇、proclin300(生物防腐劑)、巰基乙酸、6-甲基試滷靈，去離子水加至總體積為IL混合均勻，即得。本發明人經過研究試驗，在試劑盒中加入了底物保護劑甘露醇和巰基乙酸，其中巰基乙酸作為底物保護劑未見文獻報導，雖然，甘露醇有去除自由基作用，但是必須與巰基乙酸一起應用才能達到保護劑作用；另一方面，如果甘露醇不加，巰基乙酸自身就很容易氧化和水解。本發明加入了底物保護劑甘露醇和巰基乙酸後，確保了試劑的穩定性。本發明的試劑盒檢測效果好，對試劑中的人工合成的底物有很強的保護作用，隨著時間的推移，對底物的保護作用會更明顯，有較大的臨床應用價值。
具體實施例方式以下實施例所用試劑原料均通過市售得到。
TRIS百靈威
脫氧膽酸鈉百靈威 輔脂肪酶羅氏
氯化鈣國藥試劑集團
疊氮鈉國藥試劑集團
酒石酸國藥試劑集團
牛黃脫氧膽酸鈉百靈威
甘露醇國藥試劑集團
proclin300 (生物防腐劑) 國藥試劑集團疏基乙酸
6-甲基試齒靈 5g羅氏實施例1製備脂肪酶檢測試劑盒組成:試劑1: (2L)(試劑體積)
TRIS緩衝液36.5g
脫氧膽酸鈉1.66g
輔脂肪酶1.8mg
氯化鈣2.66g
疊氮鈉Ig去離子水加至總體積為2L；試劑2: (IL)(試劑體積)
酒石酸2.2g
牛黃脫氧膽酸鈉5.2g
甘露醇18.2g
proclin300(生物防腐劑) 0.05ml
巰基乙酸0.92g
6-甲基試滷靈0.02g去離子水加至總體積為1L。製備:(一 )製備試劑 1: (2L)(I)先向容器內加入1.6L的去離子水；(2)依次加入TRIS緩衝液、脫氧膽酸鈉、氯化鈣、疊氮鈉；
(3)加入酶:輔脂肪酶(4)最後加入去離子水至總體積為2L混合均勻，即得；( 二 )製備試劑 2: (IL)向容器內依次加入酒石酸、牛黃脫氧膽酸、甘露醇proclin300 (生物防腐劑)、巰基乙酸、6-甲基試滷靈、去離子水加至總體積為2L，混合均勻。實施例2試劑1: (2L)
mops緩衝液25.3g
脫氧膽酸鈉1.82g
輔脂肪酶2.2mg
氯化鈣1.44g
疊氮鈉1.2g去離子水加至總體積為2L。試劑2: (IL)酒石酸1.8g
牛黃脫氧膽酸鈉5.27g
甘露醇14.2g
proclin300 (生物防腐劑)0.03ml
巰基乙酸1.47g
6-甲基試滷靈0.022g去離子水加至總體積為1L。實施例3試劑1: (2L)
bicine緩衝液20.8g
脫氧膽酸鈉1.58g
輔脂肪酶1.5mg
氯化鈣2.8g
疊氮鈉Ig去離子水加至總體積為2L。試劑2: (IL)
酒石酸1.95g
牛黃脫氧膽酸鈉3.13g
甘露醇18.2g
proclin300 (生物防腐劑)0.05ml
巰基乙酸0.92g
6-甲基試滷靈0.02g去離子水加至總體積為1L。製備方法同實施例1實施例4本發明實施例1的試劑盒檢測效果試驗:測定方法:步驟一:輸入參數於自動生化分析儀:溫度37°C，主波長583nm，副波長800nm，Rl 300ul (實施例1試劑I).R2150ul (實施例1試劑2).
對照試劑:瑞士羅氏脂肪酶試劑盒(試劑1300ul ;試劑2150ul，其中未加入甘露醇、巰基乙酸)生產商(瑞士羅氏公司)；檢測樣本4ul (血清樣本)
讀數點:16-24步驟二:測定前將Rl與R2平衡至室溫.，然後放入試劑倉內步驟三輸入定標因子:2218在使用時，試劑I加檢測樣本後再加入試劑2，即可進行檢測。(I)實施例1試劑加甘露醇、巰基乙酸作為保護劑與樣本試劑對檢測反應的影響
權利要求
1.一種酶法檢測脂肪酶試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒由下列試劑I和試劑2按I份:I份的比例組成: 試劑1:2L緩衝液10—20 O mmol /L脫氧膽酸鈉0.01-20 ml/L輔脂肪酶0.l-2mg/L氯化齊5-20mmol/L 疊氮鈉0.5-2g/L 去離子水加至總體積為2L試劑2:1L酒石酸10-200 mmol/L牛黃脫氧膽酸鈉0.l-10mmol/L甘露醇10-200 mmol/L proclin300 (生物防腐劑)0.01-0.5ml/L疏基乙酸10-200 mmol/L 6-甲基試滷靈0.1-0.5 mmol/L 去離子水加至總體積為IL。
2.根據權利要求1所述酶法檢測脂肪酶試劑盒，其特徵在於，所述試劑I的緩衝液選自TRIS、MOPS 或 HEPES。
3.—種如權利要求1所述酶法檢測脂肪酶試劑盒的製備方法，其特徵在於，所述試劑盒由下列試劑I和試劑2按I份:I份的比例組成: 試劑1:2L緩衝液10—20 O mmol/L脫氧膽酸鈉0.01-20 ml/L輔脂肪酶0.l-2mg/L 氯化齊5-20mmol/L疊氮鈉0.5-2g/L 去離子水加至總體積為2L 試劑2:1L酒石酸10-200 mmol/L 牛黃脫氧膽酸鈉0.l-10mmol/L甘露醇10-200 mmol/L proclin3000.01-0.5ml/L 疏基乙酸10-200 mmol/L 6-甲基試滷靈0.1-0.5 mmol/L 去離子水加至總體積為IL 所述製備方法包括下列步驟: (一)製備試劑1:2L (1)先向容器內加入為總量80%的去離子水； (2)依次加入緩衝液、脫氧膽酸鈉、氯化鈣、疊氮鈉； (3)加入輔脂肪酶； (4)最後加入去離子水至總體積為2L，混合均勻，即得； (二)製備試劑2:1L 向容器內依次加入牛黃脫氧膽酸鈉、甘露醇、proclin300、巰基乙酸、6-甲基試滷靈,去離子水加至總體積為1L， 混合均勻，即得。
全文摘要
本發明公開了一種酶法檢測脂肪酶試劑盒。本發明試劑盒由試劑1和試劑2組成。試劑12L緩衝液10-200mmol/L、脫氧膽酸鈉0.01-20ml/L、輔脂肪酶0.1-2mg/L、氯化鈣5-20mmol/L和疊氮鈉0.5-2g/L，去離子水加至總體積為2L。試劑21L酒石酸10-200mmol/L、牛黃脫氧膽酸鈉0.1-10mmol/L、甘露醇10-200mmol/L、proclin3000.01-0.5ml/L、巰基乙酸10-200mmol/L、6-甲基試滷靈0.1-0.5mmol/L，去離子水加至總體積為1L。本發明的試劑盒，對底物有很強的保護作用，提高了試劑的穩定性。本發明的試劑盒檢測效果好，有較大的臨床應用價值。
文檔編號C12Q1/44GK103173518SQ20111043079
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月20日 優先權日2011年12月20日
發明者景晟, 孫衛兵 申請人:上海復星醫藥(集團)股份有限公司, 上海復星長徵醫學科學有限公司